间接竞争酶联免疫分析法测定葛根中葛根素的含量

单文超 冯会宾 赵琰 曾文浩 贺娜娜 赵妍 孙晔 屈会化

·论著·

间接竞争酶联免疫分析法测定葛根中葛根素的含量

单文超 冯会宾 赵琰 曾文浩 贺娜娜 赵妍 孙晔 屈会化

目的 利用间接竞争酶联免疫分析法(indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay,ic-ELISA)测定葛根中葛根素的含量。方法 利用抗葛根素单克隆抗体,通过线性关系、精密度、回收率的考察,建立葛根素的ic-ELISA分析方法。结果 该方法的线性范围为15.6～500 ng/mL,孔间差和板间差均不大于3.5%,平均回收率为101.8%,并且该法检测结果与高效液相色谱法检测结果一致。结论 本实验为葛根质量控制以及含葛根药材的中药复方中葛根素的含量测定提供了一种新技术方法。

间接竞争酶联免疫分析法; 葛根素; 葛根; 含量测定

葛根为豆科植物野葛Pueraria lobata(Willd.) Ohwi的干燥根[1],具有解肌退热、透发麻疹、生津止渴、升阳止泻的作用[2]。葛根素属于异黄酮类,是葛根的质量控制成分[1],已被广泛地应用于治疗临床多种疾病[3-5]。

葛根素的含量测定主要采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)[6-8]。近年来,基于小分子单克隆抗体[9-14]建立的间接竞争酶联免疫分析法(indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay,ic-ELISA)具有特异性强,灵敏度高,重复性好,简便快捷,前处理简单,经济无污染[15]等特点,特别适用于微量基质生物样品中小分子含量的分析。在ic-ELISA基础上建立的胶体金快速检测试纸可实现中药材的现场快检,更是引起了药品监管部门的关注。

本研究利用实验室制备的抗葛根素单克隆抗体[16],建立了葛根素ic-ELISA法,准确测定了葛根中葛根素的含量,为微量基质生物样品中葛根素的含量分析及葛根素胶体金快速检测试纸的研究奠定了基础。

1 材料与仪器

葛根素对照品(中国食品药品检定研究院,含量96%,批号:110752-200912),不同批次(3批)葛根饮片均购于同仁堂药店。

高效液相色谱仪(Agilent Technologies 1260 Infinity),甲醇(色谱纯,fisher),双蒸水(娃哈哈), ELISA分析及其他相关药品如磷酸盐和Tween-20等均为国产分析纯。酶标二抗(HRP标记羊抗鼠IgG,GeneScript公司),四甲基联苯胺(TMB)(美国Amercso公司),96孔酶标板,酶标仪(Themo MK3型酶联检测仪)。

2 方法与结果

2.1 葛根素单克隆抗体的制备

本实验室采用高碘酸钠法[17]成功合成了葛根素的人工抗原,并成功筛选出能够分泌抗葛根素单克隆抗体的细胞株AA9,通过腹水生产法制备出葛根素单克隆抗体[16]。具体过程为:取6～8周龄的雄性 BALB/C小鼠腹腔注射弗氏不完全佐剂0.2 mL/只;5天后,接种细胞株AA9;接种10天后,待小鼠腹部明显膨大,收集腹水,3000 rmp离心20分钟,离心后收集上清,分装,于-20℃冻存。

2.2 葛根素单克隆抗体最佳工作浓度的确定

葛根素单克隆抗体以PBS(0.01 mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液)分别稀释为1∶2000,1∶4000, 1∶8000,1∶16000,1∶32000之后,以每孔100μL加入到已预先包被并封闭好的酶标板中。按照常规ic-ELISA法测定A450值,恒温培养箱37℃孵育1小时,PBST洗板3次;辣根过氧化氢酶标记的羊抗鼠IgG用磷酸盐缓冲液1∶20000倍稀释后,以100μL/孔加入,恒温培养箱37℃孵育1小时,PBST洗板3次;TMB显色液100μL/孔加入,恒温培养箱37℃孵育30分钟,以50μL/孔加入终止液(2 mol/L硫酸)后立即放入酶标仪,检测450 nm处的吸光值。选定葛根素单克隆抗体的最佳工作浓度。

结果测得上述由1∶2000至1∶32000的5个稀释比的A450值分别为1.43,1.28,1.02,0.83, 0.63。因酶标仪测定A值的敏感范围在1.00左右,为保证测定结果的灵敏可靠,抗体稀释比可选择为1∶8000。因此,选取葛根素单克隆抗体最佳稀释比为1∶8000。

2.3 Ic-ELISA方法学考察

2.3.1线性关系 (1)包被:96孔酶标板加入经0.01 mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液(PBS)1∶4000稀释的包被原,孵育1小时后,用洗涤缓冲液(PBS with Tween-20,PBST)洗板3次;(2)封闭:以10%马血清为封闭液,37℃封闭反应1小时;(3)加样:不同质量浓度梯度的葛根素对照品溶液(以水溶解稀释)与葛根素单克隆抗体(1∶8000稀释)的混合液(1∶1)加入酶标板的测定孔中,孵育0.5小时,洗板。以加有葛根素质量浓度为0的混合液的测定孔为阳性对照孔,以只加PBS溶剂的测定孔为空白对照孔;(4)加酶标二抗:加入经PBS 1∶10000稀释的酶标二抗,孵育0.5小时,洗板;(5)显色与测定:加入显色液TMB,显色15分钟,以2 mol/L硫酸溶液终止反应,用酶标仪测定各孔在波长450 nm处的吸光度A值。以上孵育过程均在37℃恒温孵育箱中完成。以葛根素对照品质量浓度的对数(X)为横坐标,其对应计算所得的A/A0(A0为阳性对照孔的吸光度)为纵坐标,绘制标准曲线,求得回归方程为:Y=-0.159ln(x)+1.2145,R2=0.9921,以抑制率达到50%时所对应的葛根素质量浓度为ic-ELISA的灵敏度IC50,结果显示该单克隆抗体抗葛根素的灵敏度为89.5 ng/mL。该法检测葛根素的线性范围为15.6～500 ng/mL。见图1。

2.3.2 精密度试验 取6个不同质量浓度的葛根素对照品溶液,按照“2.3.1”项下ic-ELISA法进行测定,每个浓度设置3个平行孔,每个样品重复3次,分别测定孔间差和板间差,对测定结果进行数据分析可知,平行孔之间检测值的RSD为0.1% ～3.3%,各酶标板之间检测值的RSD为0.5% ～3.5%。见表1。

2.3.3 回收率实验 精密吸取已知含量的(20 ng/mL)葛根素溶液共6份,分别加入等体积的葛根素对照品10、20、40、80、160、320 ng/mL,混匀后葛根素的质量浓度为 15、20、30、50、90、170 ng/mL。按照本实验所建立的ic-ELISA法测定其在450 nm波长处的吸收值。每个浓度平行测定6次,带入标准曲线线性方程计算,测得浓度分别为14.1、21.2、28.4、52.3、95.0、180.3 ng/mL。回收率为94.0%、106.0%、94.7%、104.6%、105.6%、106.1%,回收率均值为101.8%。

2.3.4 含量测定 不同批次的葛根饮片分别称取3 g,加6倍量水煎煮2次,每次2小时,合并煎液,滤过,浓缩,去离子水定容至50 mL,制备葛根供试品溶液[18]。分别采用本实验建立的ic-ELISA法和传统HPLC对葛根中葛根素含量进行测定,平行测定3次。Ic-ELISA测定:回归方程为:Y=-0.159 ln (x)+1.2145,稀释至适宜倍数后,按照“2.3.1”下方法检测葛根提取液中葛根素的含量。HPLC测定:参考 2010年版中国药典(一部),选用 Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,5μm),流动相为甲醇与水(25∶75)(V∶V),检测波长250 nm,进样量10μL(标准曲线为Y=43.475x+ 0.4417)。两种方法检测结果见表2,采用Excel软件进行t检验,P=0.478＞0.05,两组数据差异无统计学意义。因此,ic-ELISA与HPLC检测结果具有一致性,从而验证了所建立的ic-ELISA的准确性。

表2 3批葛根饮片中葛根素的含量(±s,n=3)

含量测定(μg/mL)批次HPLC ic-ELISA 1 186±2.1 194±7.8 2 232±3.1 210±8.0 3 234±5.2 246±6.5

3 讨论

本实验室合成了葛根素人工抗原,筛选出能稳定分泌抗葛根素的特异性杂交瘤细胞系,制备出抗葛根素的单克隆抗体,检测抗体效价大于128 000,检测灵敏度为89.50 ng/mL,且对结构类似黄酮类化合物显示极低的交叉反应(＜0.01%)(另文发表)。在此基础上,本研究建立了葛根素ic-ELISA方法。

Ic-ELISA方法的建立会受到很多因素的影响,除了单克隆抗体的质量因素外,还包括包被原的工作浓度、封闭液种类、单抗的工作浓度等。按照常规ic-ELISA法测定,本实验最终确定:包被原最佳工作浓度为1∶4000,封闭液为10%马血清,葛根素单抗最佳工作浓度为1∶8000。

Ic-ELISA法逐渐应用于中药现代化的化学成分检测与质量控制评估领域,成为仪器分析技术的补充。目前,对于葛根素的含量测定主要采用高效液相色谱法、薄层色谱法、毛细管电泳法等,其中高效液相色谱法最为常用。但是上述方法或样品前处理过程复杂,或仪器昂贵、检测成本高,或对操作人员实验技能要求较高。Ic-ELISA法的优势主要体现在:(1)与常规理化分析技术相比,具有特异型强、灵敏度高的特点,甚至可检测到飞摩尔或亚飞摩尔低浓度水平;(2)方便快捷,取样量少,前处理简单,仪器化程度低,分析效率约为HPLC或GC的几十倍。

本实验准确测定了葛根中葛根素的含量,因此利用此技术的准确性以及灵敏度高、特异性强等优点,可分析中药复方中葛根素在血液、器官及组织样品中的含量分析;甚至可以制成葛根素胶体金试纸条、试剂盒等,从而为中药质量控制以及中药作用机制的阐明奠定基础。

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Content determ ination of puerarin in puerariae lobatae radix by ic-ELISA

SHANWen-chao,FENGHui-bin,ZHAO Yan,et al. The School of Chinese Medicine,Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102,China

QU Hui-hua,E-mail:quhuihua@gmail.com

Objective To detect the content of puerarin in puerariae lobatae radix by ic-ELISA. Methods Anti-Puerarin monoclonal antibodieswere used to establish ic-ELISAmethod for puerarin by investigating the linear relationship,the precision and the recovery.Results The linear range of thismethod was 15.6 ng/mL～500 ng/mL,the coefficients of variation for the intra-assay and the inter-assay are both less than 3.5%and the average recovery was 101.8%.The detection result of ic-ELISA method was consistentwith that of HPLC test.Conclusions The ic-ELISA method can be applied to the quality control of puerariae lobatae radix and the content determination of puerarin in Chinese herbal formula.

ic-ELISA; Puerarin; Puerariae lobatae radix; Content determination

R284.1

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2015.09.014

2014-11-27)

(本文编辑:蒲晓田)

国家自然科学基金(81274043)

100102 北京中医药大学中药学院[单文超(硕士研究生)、冯会宾(硕士研究生)、曾文浩(硕士研究生)、贺娜娜(硕士研究生)],基础医学院[赵琰、赵妍(博士研究生)、孙晔(博士研究生)],科研实验中心(屈会化)

单文超(1990-),女,2013级在读硕士研究生。研究方向:中药化学。E-mail:shan0913bj@163.com

屈会化(1966-),博士,副研究员。研究方向:中药免疫分析。E-mail:quhuihua@gmail.com