人羊膜间充质干细胞应用于颞下颌关节骨关节病的展望

杨晔 张跃蓉

颞下颌关节紊乱病(temporomandibular disorders，TMD)，是一种多因素互相作用产生的疾病。其中颞下颌关节骨关节病，是TMD的常见类型，患发病后，出现关节软骨的器质性改变，造成不可逆的缺损破坏，导致患者生活质量下降。人羊膜间充质细胞(hAMSCs)具有间充质干细胞的特性和多向分化潜能以及低免疫原性，在适当的条件下，可以诱导其向软骨细胞分化。这就为颞下颌骨关节病的治疗提供了新的思路。本文就颞下颌关节骨关节病及人羊膜间充质干细胞的软骨分化潜能应用于颞下颌关节骨关节病治疗展望。

1 颞下颌关节骨关节病

马绪臣［1］认为，TMD是一组多种因素相互作用产生的疾病。目前病因尚未完全清楚。其中颞下颌关节骨关节病，常伴有下颌运动异常、疼痛、弹响和杂音等症状［2］。影像学和关节内镜等辅助手段检查发现，其关节盘、髁突等均发现出现了退行性改变，X线检查可见骨质吸收、破坏、硬化、囊变等，同时可见髁突前斜面磨平，骨赘形成等，也可见关节盘上下腔穿通和移位［2］。

在颞下颌关节骨关节病的治疗中，多采用理疗、颌垫治疗、药物治疗及关节内注射等保守治疗为主的综合治疗［1，3］。由于关节软骨无血管、神经，因此当各种原因造成软骨缺损时，其自身修复能力有限，而保守治疗无效，方可采用外科手术方法［4］。然而，颞下颌关节术后并发症也不容忽视，尤其是随着时间的推移［3］，植入颞下颌关节内的代用品常会引起关节组织退行性变化，最终造成关节窝骨质穿孔等病症，带给患者更大的伤害和痛苦。因此，国内外的学者一直在探究治疗颞下颌关节骨关节病更理想的方法。而随着干细胞研究的深入，利用间充质干细胞的多向分化潜能的组织工程为临床治疗颞下颌关节骨关节病带来了新的前景［5］。

2 间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)的临床前研究

MSC是干细胞中的一种，来源于中胚层。1966年Friedenstein等［6-8］首先在骨髓中发现，进而研究发现羊膜、脂肪等组织中同样具有MSC。MSC免疫原性低，增殖能力强和多向分化潜能等优点［9-11］，在适当条件下能向骨、软骨、脂肪、神经等多种组织分化。

临床多采用骨髓MSC治疗骨和软骨病，2010年，Matsumoto等［12］在关节软骨病的临床研究中，应用骨髓MSC自体移植治疗，证明这种方法是安全，有效的。徐斌等［13，14］利用动物模型，建立软骨与骨髓 MSC共培养系统在体内外诱导软骨细胞的研究证明，软骨细胞微环境能有效诱导骨髓MSC向软骨分化。

但骨髓MSC的获取是有创伤的过程，同时研究表明随着年龄的增长，骨髓的质量和数量会下降［15］。羊膜间充质干细胞(HAMSCs)是间充质干细胞中的一种，相比于骨髓MSC，HAMSCs具有更多优势，尤其是来源方面，它来源于废弃的胎盘，而胎盘在孕妇分娩过程中被排出体外，不需要进行额外的手术操作，不存在伦理问题。同时它具有比骨髓MSC更强的分化能力［9］，并且来源丰富。既往的研究发现，HAMCs表达HLA-A，B和C，不表达HLA-DR，HL A-G呈弱阳性表达，也有研究发现，羊膜细胞能够抑制激活的外周血单核细胞(PBMCs)的增殖;HAMSCs应用于眼科移植术的研究，结果未出现排斥反应［10，11］，证明其免疫原性低，认为HAMSCs是一种免疫赦免物质。藉此表明HAMSCs是治疗关节软骨病的理想材料

3 HAMSCs的来源，分离和培养及鉴定

3.1 HAMSCs的来源 羊膜位于胎盘绒毛膜表面，羊膜腔内充满羊水。主要由来源于外胚层的上皮细胞和来源于中胚层的间充质细胞组成。厚度为0.02～0.05 mm，是人体中最厚的基底膜。有韧性，无血管，神经和淋巴管。可分为上皮层，基底膜层，致密层，纤维母细胞层和海绵层。HAMSCs来源于胎盘羊膜组织，具有间充质干细胞的特征。

3.2 HAMSCs的分离和培养 HAMSCs分离，多采用机械法剥离胎盘羊膜组织，两步酶消化法获取。即先胰蛋白酶消化并弃除羊膜上皮细胞，再将剩余羊膜组织充分剪碎，胶原酶消化。这样对HAMSCs保护较好，可大量获取高活性和均一的细胞［16］。同时，有学者也提出可以用细胞表面标志物CD49d鉴别HAMCs和人羊膜上皮细胞(HAECs)［17］。比较不同妊月的胎盘羊膜所能获取的细胞数量，以足月胎盘羊膜可以获得5×108个HAMCs为最多，但也与处理羊膜过程有关［18，19］。

HAESCs的体外培养采用DMEM:F12培养基，加入胎牛血清(FBS)、碱性成纤维生长因子(bFGF)，置于37℃、饱和湿度、体积分数为5%的CO2培养箱中培养48～72 h后，根据细胞生长情况，待细胞达到80%～90%融合时，胰酶消化传代［20］。通过记录生长曲线可以看出，HAMSCs开始时增殖旺盛，第2天开始就进入对数生长期，第7天达到生长高峰，第8天后进入平台期，细胞增殖明显变缓［21］。

3.3 HAMSCs干细胞表型特征的鉴定 免疫荧光检测显示，HAMSCs表达干细胞表面标记物Oct-4，SSEA-4，而Oct-4，被公认为是多能干细胞自我更新和分化的基因［22］。免疫细胞化学染色检测结果显示，所分离的原代HAMSCs表达波形蛋白，而不表达上皮细胞标志CK19，流式细胞术分析显示，原代培养的HAMSCs高表达CD29和CD44［21］。以上检测均证实HAMSCs具有干细胞的生物学特性.

4 HAMSCs的软骨诱导分化潜能

HAMSCs具有多向分化潜能，其中之一是分化成为中胚层的软骨组织，在妊娠早期(7～14周)和妊娠晚期(34～40周)羊膜中分离获得的间充质干细胞可向软骨细胞分化，表达软骨特异性的Ⅱ型胶原蛋白［23］。Soncini等［24］和宋秀军［25］均报道在体外成功诱导HAMSCs分化成软骨细胞。另有研究应用共同诱导分化、上清诱导法也获取了同样的成功［26，27］。

5 HAMSCs在颞下颌关节骨关节病中的展望

由于HAMSCs所具有取材容易，来源丰富，强增值性，低免疫原性和多向分化能力并且符合伦理的优点。因此利用HAMSCs的干细胞特性治疗颞下颌骨关节病，是区别于传统方法的新途径。目前，在治疗性研究中，杨兴华等［28］利用动物实验，采用骨髓MSC治疗颞下颌关节骨关节病，效果良好。说明这是治疗颞下颌骨关节病的可行方法。HAMSCs属于间充质干细胞家族，并且在取材，来源，增殖性等各方面均强于骨髓间充质干细胞。尤其是HAMSCs在实验中诱导软骨的成功，为治疗颞下颌骨关节病的临床应用奠定了基础。在未来的研究中，HAMSCs诱导为软骨的分子机制，及其在临床应用中的安全性，相容性等还需要进一步详细探索，以使其诱导的软骨细胞能更好地接近颞下颌关节软骨，最终实现颞下颌关节软骨的修复和再生。

1 马绪臣主编.颞下颌关节病的基础与临床.第1版.北京:人民卫生出版社，2000.102-116，197-201.

2 邱蔚六主编.口腔颌面外科学.第6版.北京:人民卫生出版社，2008.324-333.

3 谷志远，傅开元，张震康主编.颞下颌关节紊乱病.第1版.北京:人民卫生出版社，2007.309-325.

4 Maegawa N，Kawamura K，Hirose M，et al.Enhancement of osteoblastic differentiation of mesenchymal stromal cells cultured by selective combination of bone morphogenetic protein-2(BMP-2)and fibroblast growth factor-2(FGF-2).J Tissue Eng Regen Med，2007，1:306-313.

5 Abdallah BM，Kassen M.Human mesenchymal stem cells:from basic biology to clinical applications.Gene Ther，2008，15:109-116.

6 Friedenstein AJ，Piatetzky-ShapiroⅡ，Petrakova KV.Osteogenesis in transplants of bone marrow cells.JEmbryol Exp Morphol，1966，16:381-390.

7 Magatti M，De Munari S，Vertua E，et al.Human amnion mesenchyme harbors cells with allogeneic T-cell Suppression and Stimulation capabilities.Stem Cells，2008，26:182-192.

8 Locke M，Ussher JE，Mistry R，et al.Transduction of human adipose-derived mesenchymal stem cell by recombinant adeno-associated virus vectors.Tissue Engineering Part C:Methods，2011，17:949-959.

9 穆晓红，徐林，赵子义，等.人胎盘与骨髓源性间充质干细胞体外培养及生物学特性对比.中国组织工程研究与临床康复，2009，13:3708-3712.

10 王乐，周辉.羊膜的生物学特性及眼科应用进展.实用临床医学，2006，7:155-157.

11 文道源，袁进，陈家祺.羊膜的应用与生物学改良.中华眼科杂志，2006，42:361-364.

12 Matsumoto T，Okabe T，Ikawa T，et al.Articular cartilage repair with autologous bone marrow mesenchymal cells.J Cell Physiol，2010，225:291-295.

13 徐斌，周亮，王英明，等.同种异体脱钙骨与骨髓间充质干细胞关节腔内共培养:与同腔软骨性状的对比.中国组织工程研究，2014，18:1165-1171.

14 詹兴旺，姜艳，王文良.SPIO标记骨髓间充质干细胞和软骨细胞共培养的研究.中国矫形外科杂志，2011，19:769-773.

15 赵子义，郭希民，王常勇，等.成人骨髓基质干细胞的分离和纯化中华创伤骨科杂志，2004，6:740-743.

16 肖盼，陈剑，王彦平等.不同消化分离方法分离人羊膜间充质干细胞效果比较.中国病理生理杂志，2010，26:1033-1037.

17 Wolbank S，Peterbauer A，Fahrner M，et al.Dose-dependent immunomodulatory effect of human stem cells from amniotic membrane:a comparison with human mesenchymal stem cells from adipose tissue.Tissue Eng，2007，13:1173-1183.

18 Casey ML，MacDonald PC.Interstitial collagen synthesis and processing in human amnion:a property of the mesenchymal cells.Biol Reprod，1996，55:1253-1260.

19 Alviano F，Fossati V，MarchionniC，et al.Term amniotic membrane is a high throughput source for multipotent mesenchymal stem cells with the ability to differentiate into end-othelial cells in vitro.BMC Dev Biol，2007，21，7:11.

20 李海建，张广静，江兰，等.人羊膜间充质细胞分离培养及其干细胞特性研究.现代生物医学进展，2011，2:227-229.

21 方宁，张路，宋秀军，等.人羊膜间充质干细胞的分离、培养及鉴定.遵义医学院学报，2009，32:234-236.

22 Niwa H，Masui S，Chambers I，et al.Phenotypic complementation establishes requirements for specific POU domain and generic transactivation function of Oct-3/4 in embryonic stem cells.Mol Cell Biol，2002，22:1526-1536.

23 PortmannLanz CB，SchoeberleinA，Huber A，et al.Placental mesenchymal stem cell as potential autologous graft for pre-and perinatal neuroregeneration.Am J Obstet Gynecol，2006，194:664-673.

24 Soncini M，Vertua E，Gibelli L，et al.Isolation and characterization of mesenchymal cells from human fetal membranes.Tissue Eng Regen Med，2007，1:296-305.

25 宋秀军，陈代雄，方宁，等.人羊膜间充质细胞具有分化成软骨及成骨细胞的潜能.中国组织工程研究与临床康复，2007，11:10056-10060.

26 周峰，王英振，张海宁，等.人软骨细胞培养上清诱导脐血间充质干细胞向软骨细胞分化.中国组织工程研究，2013，17:7034-7039.

27 李丽艳，杜江，黄金中，等.兔软骨细胞诱导人脐血间充质干细胞成骨的可行性.中国组织工程研究与临床康复，2009，13:9713-9714.

28 杨兴华，彭琳，刘云生，等.骨髓间充质干细胞治疗颞下颌关节骨关节病.中国组织工程研究，2013，17:3488-3494.