道地药材分子标记的研究进展

2015-03-19罗洪斌,商楠

湖北民族大学学报(医学版) 2015年3期

道地药材分子标记的研究进展

罗洪斌，商楠

湖北民族学院医学院(湖北恩施 445000)

【关键词】道地药材；分子标记；进展

“道地药材”又称“地道药材”[1]，是指在特定的土壤条件、自然气候等环境因素影响下，来自特定产区、加工技术精细、在历史上形成的品质优良、疗效确切而被社会一致公认的中药材。从生物学角度出发，“道地性”与道地药材的表型、遗传背景及环境三者有关[2]，它是遗传、环境及药材表型三者在长期协同进化过程中，在某个特定时空上的一个反映。换言之，道地药材的形成是特定的基因型，在特定的生境下受到复杂的调控，导致某些代谢过程的关键酶基因的表达产生了时空差异的产物[2-3]。因此，有必要对道地药材进行遗传资源的研究和保护。道地药材的分子机制研究，就是要在分子水平揭示道地药材居群水平的遗传变异，明确道地药材的基因型特征，以及环境对道地药材基因表达的影响，从而揭示遗传因素对道地药材形成的贡献率，并为道地药材的鉴定提供特有的分子标记，从而可以在分子水平实现道地药材的鉴别。

目前，应用于道地药材鉴定的分子标记技术主要有SCAR、RFLP、RAPD、PCR-RFLP、ISSR、DNA测序和位点特异性鉴别PCR等，广泛应用于人参[4]、枳壳[5]、芍药[6]、苍术[7]、半夏[8-9]、厚朴[10]、石斛[11-13]等道地药材的遗传多样性的评价。其中DNA测序技术可直接对基因序列进行分析鉴定，通过直接测序的方法，掌握道地药材特征性分子标记的碱基序列发生的细微变化并加以比较，从而达到鉴别中药材的目的。由于核酸分子包含着生物遗传的信息，同时也记载着生物进化的历史，即核酸结构不仅指导生物的形态建成和个体发育，而且还能够反映生物之间的亲缘关系。DNA核苷酸序列的测定，对于了解基因及其产物的结构、基因表达以及分子进化等具有重要意义，同时确定DNA核苷酸序列也是获得DNA分子间变异最为本质的信息。在道地药材道地性的分子机制研究中，通过基因直接测序技术而广泛应用的分子标记主要有核糖体DNA(nrDNA)的18S rRNA基因和内转录间隔区(ITS)非编码区序列、叶绿体DNA(cpDNA)的rbcL基因、matK基因和trnH-psbA非编码区序列等。下面将对以上分子标记进行详细综述。

1　18S rRNA基因

真核生物中18S rRNA基因编码核糖体小亚基的18S RNA，为高重复序列，以连续排列方式存在于细胞内，序列长约1850bp，是唯一具有信息分子和功能分子两种作用的编码nrDNA的基因。目前，18S rRNA基因广泛应用于道地药材的分子鉴定，如Fushimi等[14]从人参、西洋参和竹节参新鲜植物材料以及相关药材中提取DNA，对18S rRNA片段进行扩增和测序，结果发现这3种人参属植物在18S rRNA片段的第497、499、501和712号核苷酸序列不同，表明18S rRNA片段上500 bp左右位置的核苷酸序列差异可作为一种基因标记用来鉴别人参及相关药材。刘玉萍等[15]采用PCR直接测序技术分析了它们的核基因组18S rRNA序列，根据序列比较发现广山药与正品山药的18S rRNA序列完全相同，而与土山药和方山药在序列上存在明显差异，序列同源性分别为99.89%和 97.51%，结果表明DNA测序技术测定的18S rRNA基因序列可成为山药基源鉴定准确而有效的分子方法。本文作者也对恩施州道地药材板桥党参和五鹤续断分别进行了18S rRNA基因的序列分析[16-17]，结果表明18S rRNA基因序列可作为分析这两种恩施独有的道地药材的鉴定分子标记。罗集鹏等[18]对藿香属内广藿香、土藿香和茴藿香的18S rRNA基因也进行了克隆和序列分析，发现广藿香和土藿香在18S rRNA序列有18个碱基变异位点和11个排序间隙，土藿香和茴藿香在18S rRNA序列有4个碱基变异位点和6个排序间隙，这些结果能很好的分辨出三者差异。

2　ITS

ITS为nrDNA的非编码区，并被5.8S分为ITS1和ITS2两部分，其转录物对nrDNA的成熟起重要作用。ITS区既具有核苷酸序列的高度变异性又有长度上的保守性，因此这些间隔区的序列易在近缘类群间排序，同时又提供了丰富的遗传信息。通常，ITS在研究属内种间和较近属间关系时都表现出较高的趋异率和信息位点百分率，而且对于揭示异域或间断分布居群间的关系也具有潜力[19]。这些特点使ITS不仅适宜药材真伪鉴定，还成为道地性评价的一种有力手段。目前，ITS是这一领域中应用最为广泛的基因片段之一，已在许多药用植物的研究中得到了应用。周联等[20]以各地产姜科药用植物阳春砂及常见伪品为材料，对其nr-DNA-ITS序列进行了测定和分析，结果表明，6个阳春砂和绿壳砂的ITS2序列完全一致，各样品的5.8S序列也完全一致，但各样品在ITS1中却有不同的碱基位点。据此，周联等认为，应用ITS1序列可对阳春砂的道地性进行鉴别。余永邦等[21]对14个不同地区产太子参居群新鲜样品nrDNA基因ITS区的碱基序列进行测定，发现非道地产区安徽与道地产区江苏、福建、山东的基因型完全不同，而且同一地区野生与栽培居群亦不同，表明土壤、海拔等环境因素对基因分化有明显影响。丁小余等[22]对铁皮石斛主产区6个F型( 枫斗型)和H型(非枫斗型)居群12个新鲜样品nrDNA基因ITS区的碱基序列进行测定，发现铁皮石斛F型和H型居群内分别都具有相同的碱基序列，但这两类居群间存在2个碱基变异位点的单核苷酸多态性(SNP)，并证明铁皮石斛的“rDNA基因ITS序列-生活型性状特征-居群类型” 三者间存在着一定的相关性。本文第一作者[23]对恩施州道地药材板桥党参的ITS非编码区序列进行了相应研究，发现野生和栽培板桥党参的nrDNA-ITS序列存在两个遗传变异位点，具有遗传差异性。这些实验结果证实nrDNA中ITS非编码区能很好地鉴定道地药材的遗传相关性。

3　rbcL基因

rbcL基因编码1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/氧化酶大亚基，位于cpDNA的大单拷贝区，长约1400bp，是植物分子系统学研究中应用最普遍的基因之一，已在中药材的系统发育中得到一定应用。袁佐清等[24]对云南西双版纳地区的石斛属植物进行了rbcL基因序列的变异及系统发育研究，表明石斛在进化过程中具有较高的遗传多样性，可以很好地应用于其道地性研究。秦民坚等[25]对射干及类似药用植物的cpDNA rbcL基因序列进行了分析，认为通过该基因序列能很好地鉴别这几种植物。这些实验证实rbcL基因在中药材道地性研究中能得到很好地应用。但相比以上两种分子标记来说，rbcL基因在道地药材分子鉴定应用方面还应用不普及，受到一定限制，可加强此方面研究。

4　matK基因

matK基因位于叶绿体trnK基因的内含子中，长约1550bp，编码一种参与RNA转录体中II型内含子剪切的成熟酶，是叶绿体基因组的蛋白编码区中进化最快的基因之一[26]。目前有很多学者都应用了该基因进行中药材道地性的研究。罗集鹏等[18]应用PCR直接测序技术对6个不同产地的广藿香干燥叶片的matK基因和18S rRNA基因进行测序分析研究。结果表明，广藿香6个样本间的matK基因序列存在47个变异位点，18S rRNA基因存在17个变异位点。结合有关挥发油化学组成数据，为广藿香的物种鉴定和道地性评价提供了分子依据。黄琼林等[27]认为matK基因序列能很好地鉴别阳春砂仁和海南砂仁，二者存在多个基因位点的差异。刘安莉等[28]在蜘蛛抱蛋属药用植物的分子鉴定研究中发现，matK的鉴定成功率在获得的单一序列中最高(85%)，多序列组合在鉴定效率方面比单一序列有所提高，其中matK与其它序列的多序列组合进行的鉴定成功率为100%，因此，matK和psb序列可用于蜘蛛抱蛋属药用植物的鉴定。上述资料及其它证据均支持matK基因在道地药材的分子鉴别中是必不可少的要素。

5　trnH-psbA

trnH-psbA非编码区序列为叶绿体基因9个间隔区中的一个，编译速度较快，在植物种内级别分辨率高，能很好地鉴别种内差异。目前，该序列在中药材的鉴别中应用较少，仅见刘涛等在蒿属药用植物中使用trnH-psbA非编码区序列鉴别黄花蒿和茵陈蒿、青蒿，结果发现三者具有显著的不同特征差异，可依据各自特有的信息位点区分开来[29]。刘震等[30]对忍冬科药用植物DNA条形码通用序列进行了筛选，结果表明trnH-psbA非编码区序列可作为ITS2序列分类鉴定标记基因的补充序列进行分子鉴定，可以显著弥补ITS2在鉴定忍冬属物种水平上的不足。蒋昱等[31]在四川淫羊藿属植物DNA条形码筛选与鉴定研究中发现，10种四川淫羊藿属植物的分类鉴定中trnH-psbA的鉴定效果较好，ITS和rbcL鉴定效果次之，matK出现错误鉴定。因此，建议将trnH-psbA作为淫羊藿属植物的条形码，具有作为其分子鉴定标记的可行性。综上所述，运用trnH-psbA非编码区序列可应用于道地性的研究内容。

目前，以植物DNA条形码技术为代表的新技术在植物的分类鉴定中得到了广泛应用。DNA条形码技术就是利用标准的、具有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段在物种内的特异性和种间的多样性而创建的一种新的生物身份识别系统，从而实现对物种的快速自动鉴定[32]。在药用植物道地性研究中，主要也是研究其种内差异性，因此应用DNA条形码技术来研究中药材道地性应有较为广泛的应用前景。2009年11月7日至13日在墨西哥召开的第三届DNA条形码国际学术大会上，一致建议在rbcL和matK 基础之上，选择进化速率较快的ITS和trnH-psbA，共同运用对陆地植物进行标准化的快速鉴定。同时本课题组具已有文献认为18S rDNA序列在道地性药材的分子鉴定也能较好地应用，是行之有效的分子标记，因此，建议将该五种基因序列作为恩施州乃至全国道地药材鉴定的分子标记，该方法是可行的。

由于恩施土家族苗族自治州地处“老少边穷”地区，当地道地药材丰富并已形成产业化，是当地经济发展的支柱产业，因此有必要大力发展道地药材的栽培及深加工。在此过程中，道地药材种类基源品质的保证就显得格外重要。形态学鉴定具有一定的局限性和随意性，易于混淆，运用具有特征性的分子标记进行分子分类可避免形态学鉴定的局限性，能更好地反映道地药材的道地性形成机制，而目前仅有少数相关报道对其进行研究，因此有必要运用本项目设计的技术手段进行道地性形成的分子机制研究，可为制定分子鉴定标准提供基础资料，也为当地道地药材GAP研究及规范化种植保持并提高其独有的品质提供一些分子生物学的依据。

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