单管多重检测急性早幼粒细胞白血病PML-RARa融合基因3种剪切体RT-qPCR方法的建立及临床应用

单管多重检测急性早幼粒细胞白血病PML-RARa融合基因3种剪切体RT-qPCR方法的建立及临床应用

本刊主编，武汉大学人民医院李艳教授(通讯作者)指导博士研究生陈占国(第一作者)等在《PLOS ONE》(2015，10(3)e0122530，IF：3.534)发表了题为“Development and validation of a 3-plex RT-qPCR assay for the simultaneous detection and quantitation of the three PML-RARa fusion transcripts in acute promyelocytic leukemia”的研究论文，主要内容如下：

1研究背景和目的：融合基因PML-RARa阳性急性早幼粒细胞白血病(APL)患者的早期、快速诊断，将有助于APL患者早期应用反式维甲酸(ATRA)进行有效“靶向”治疗，以减少APL患者致死性出血及其并发症。然而，目前的PML-RARa的RT-qPCR检测方法存在相对费时、费力、试剂成本高等不足。现有方法的检测过程需要3个PCR反应体系同时检测PML-RARa融合基因可能存在的3种剪切体，虽每例患者只携带一种剪切体的PML-RARa融合基因。本课题组设计了一套特殊的“PML-RARa引物和探针”，用最少的引物和探针单管多重检测APL患者PML-RARa融合基因可能存在的3种剪切体，即PML-RARa bcr1、PML-RARa bcr2和PML-RARa bcr3，以便于临床对APL的分子诊断。

2主要方法：根据探针和引物的设计原则，利用PML-RARa通用引物对PML-RARa阳性标本进行筛选，采用“PCR产物胶回收+PCR产物测序”等方法加以验证，课题组发现了PML-RARa较少见的PML-RARa融合基因bcr2剪切体的拼接位点(与文献报道进行了比对)，成功设计出一套特殊的RT-qPCR引物和探针，即2条正向引物、1条反向引物和1条TaqMan MGB探针。通过ABI荧光定量PCR仪进行RT-qPCR的条件优化，课题组成员确定了PML-RARa三重RT-qPCR检测体系；最后对该体系进行性能评价。

3结果：根据所筛选的PML-RARa标本，课题组对PML-RARa的3种剪切体进行克隆，得到阳性克隆质粒，作为RT-qPCR的质粒标准品。PML-RARa检测体系的性能评价结果如下：(1)针对课题组所研发的质粒标准品，检测体系的最低灵敏度为10拷贝/每反应；(2)针对PML-RARa阳性的APL细胞株NB4，检测灵敏度为10-4，即104背景细胞中检测到一个APL肿瘤细胞；(3)批内和批间的重复性试验证实，该体系的变异系数(CV)均小于3%；(4)对319例确认为白血病(含61例APL)的初发患者骨髓样本的检测结果与用于PML-RARa检测的传统方法比较，其定性结果完全吻合；(5)本方法同时与欧洲抗癌计划协作组(EAC)推荐的单重RT-qPCR定量方法的比较结果为，对60例APL初诊骨髓标本和199例来源于57例APL患者治疗监测的随访骨髓标本采用两种方法所得PML-RARa定量结果以及灵敏度均具有高度一致性。用本课题组研发的检测体系，检测到1例APL患者存在PML-RARa融合基因 bcr2剪切体，但用EAC推荐的单重RT-qPCR方法，其结果为阴性。经测序验证，该例标本融合基因的断裂点为PML外显子6的nt1579位置。

4结论：本课题所研发的PML-RARa多重RT-qPCR方法特异、敏感、稳定、高效，可提高PML-RARa融合基因的检测效率，并简化了检测流程，大大降低了现有RT-qPCR试剂可能存在的漏检情况，可用于PML-RARa阳性APL患者的诊断和治疗监测。

注：该研究为国家自然科学基金资助项目(81000771)