高温木质素分解菌的分离、筛选及鉴定

张 亮，林 宁，阚 立

(1．南京师范大学泰州学院化学与生物工程学院，江苏泰州225300;2．泰州机电高等职业技术学校，江苏泰州225300)

木质素是由苯丙烷结构单元通过醚键和碳碳键连接而成的聚酚类三维网状高分子芳香族化合物，是构成植物细胞的主要物质，约占植物体干重的20%。它是非常丰富的碳素资源［1］。据估测，全球每年可产生约6×1014t木质素，主要存在于农作物废弃秸杆和工业造纸材料中。木质素分子空间三维结构非常复杂，在自然界中很难被微生物分解利用［2］。因此，高效降解木质素，使其资源化，日益引起人们的重视。

目前，木质素的微生物分解是由真菌、细菌等各种微生物群落共同作用的结果［3］。其中，木质素的微生物分解研究主要集中在以白腐真菌为代表的真菌上。白腐真菌能够分泌胞外氧化酶降解木质素，包括木质素过氧化物酶(Lignin peroxidase，LiP)、锰过氧化物酶(Manganesedependent peroxidase，MnP)和漆酶(Laccase)，因此，它被认为是最主要的木质素降解微生物。虽然白腐真菌具有较好的分解效果，但是它生长缓慢、产酶量低的特点使其难以推广到工业化生产应用。因此，有必要寻找新途径来实现木质素的快速分解。在木质素的降解过程中，细菌发挥一些关键性作用，如支链的改性、环开裂和解聚等，并且由于细菌的生长周期短，易培养，适合大规模生产应用。因此，细菌在木质素分解中的作用不容忽视［4］。

在细菌分解木质素的研究中，对木质素有降解能力较强的细菌主要包括链霉菌(Streptomyces)、节杆菌(Arthrobacter)、小单孢菌(Micromonospora)等放线菌，还有假单胞菌(Pseudomonas)、黄杆菌(Flavobacterium)等非丝状细菌［5］。这些细菌能够分解不同聚合形态的木质素，在木质素降解的不同阶段发挥作用。但是，白腐菌、黄孢原毛平革菌、部分细菌等属于低温木质素降解菌。虽然降解木质素能力强，但农作物秸秆发酵温度较高。这些菌在高温条件下不易存活，在此特殊环境中对木质素的降解率非常低，因此筛选高温、产酶活性强、发酵周期短的木质素分解菌具有重要意义。以新鲜马粪为供试材料，笔者筛选出高温木质素分解菌，并且对其产酶活性进行测定，通过16SrDNA测序对目的菌株进行鉴定，以期为木质素分解菌的选育和菌剂的制备提供菌种资源。

1 材料与方法

1．1 菌种来源 对采自泰州市动物园新鲜的马粪进行分离、获取。

1．2 培养基 菌种筛选培养基(BM培养基)组成为:酵母浸出液 10 g，葡萄糖 20 g，木质素 2．5 g，琼脂 15 g，水 1 000 ml，pH 7．0。产酶培养基(LB液体培养基)组成为:酵母膏5 g，胰蛋白胨 10 g，氯化钠10 g，水 1 000 ml，pH 7．0。

1．3 菌种的分离与筛选

1．3．1 初筛。将采集到的样品在LB培养基中富集后，采用平板梯度稀释法，吸取0．2 ml菌悬液均匀涂布在BM培养基上，在55℃条件下培养2～3 d，观察透明圈的大小，并且记录其直径。

1．3．2 复筛。挑取产生透明圈直径较大菌株的一个单菌落，接种到产酶培养基中培养过夜后，离心，上清液即为粗酶液，在BM培养基中打若干小孔，每个孔加入100μl粗酶液，55℃培养4 h，然后用浓度1%三氯化铁和铁氰化钾按照1∶1配制(现配现用)，染色约30 min，用浓度0．9%生理盐水脱色，观察透明圈的大小，并且记录。筛选出4株透明圈直径较大的菌株，保存于LB固体培养基中，备用。

1．4 粗酶液的制备及活性测定 从LB固体培养基挑取菌种，接种于50 ml的LB培养基中，55℃摇床培养过夜。从种子培养基中吸取5μl，转接于5 ml种子培养基中，培养至OD到0．6左右。12 000 r/min，离心5 min，上清液即为粗酶液，4℃保藏，备用，测定相关酶活［6］。

(1)漆酶的测定。向20 ml的反应体系中加入18．6 ml的50 mmoL/L的乙酸－乙酸钠缓冲液(pH 4．5)，将其在25℃预热10 min后，加入0．4 ml的10 mmol/L的愈创木酚和1 ml的粗酶液，在反应温度为25℃时测定465 nm处吸光度的增加。每分钟内氧化1．0μmol愈创木酚所需酶量为一个酶活力单位。

(2)木质素过氧化物酶的测定。向3 ml反应体系中加入1．5 ml 125 mmol/L 酒石酸(pH 3．0)、10 mmoL/L 藜芦醇1．0 ml、10 mmol/L 过氧化氢0．1 ml、粗酶液0．4 ml，加入过氧化氢后启动反应，在310 nm处测定吸光度的增加。每分钟内氧化1．0μmol藜芦醇所需酶量为一个酶活力单位。

(3)锰过氧化物酶的测定。反应体系中含有50 mmol/L乳酸钠缓冲液(pH 4．5)3．4 ml、1．6 mmol/L 硫酸锰溶液 0．1 ml、粗酶液0．4 ml，预热至 37 ℃ 后加入 1．6 mmol/L 双氧水0．1 ml启动反应，在室温条件下测定240 nm处紫外光反应3 min时OD的改变。每分钟内氧化1．0μmol的Mn2+转化成Mn3+所需酶量为一个酶活力单位。

1．5 目的菌株的鉴定 采用CTAB法提取细菌总DNA［7］;分别利用细菌16SrDNA通用引物F27/R1492进行PCR扩增。PCR反应体系(20μl):DNA模板3μl;PCR样液10μl;27F(20 μmol/L)0．8 μl;1495F(20 μmol/L)0．8 μl;ddH2O5.4 μl。PCR条件为:95℃预变性5 min，95℃变性30 s，52℃退火30 s，72 ℃ 延伸 1．5 min，30 个循环，72 ℃ 延伸 10 min。PCR产物经试剂盒纯化后，送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。

2 结果与分析

2．1 菌株的初筛 利用BM培养基初筛和复筛后，从马粪中分离出产生透明圈较大的4株细菌。透明圈直径见表1，其中X-2的透明圈直径最大，其透明圈直径与菌落直径比值也最大。

表1 所筛菌株的透明圈直径

2．2 菌株的复筛 对4株菌株漆酶、过氧化物酶和锰过氧化物酶3种酶活进行测定。由表2可知，菌株M-2产漆酶和锰过氧化物酶活性最强，M-4菌株产过氧化物酶活性最强。因此，选择M-2菌株进行后续种属鉴定。

2．3 目的菌株的鉴定 通过对M-2菌株的16SrDNA序列进行比对后，发现该菌株的16SrDNA序列与假单胞菌属的绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)同源性最高，序列相似性为85%(图1)。因此，最终确定M-2菌株为假单胞菌属的绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)。

表2 高温木质素分解菌的产酶活性 U/ml

3 讨论

通过初筛和复筛，从马粪中获得4株具有分解木质素的菌株，其中M-2的产酶活性较强。经16SrDNA遗传学鉴定，确定M-2为假单胞菌属的绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)。菌株M-2在高温条件下具有生长速度快和产酶活性强的能力。有研究表明，在没有外界添加任何外源碳氮源，将分离获得的芽孢杆菌接种到秸秆木质素中进行堆积发酵，表现出较强的降解作用。通过玉米秸秆16 d的发酵，木质素降解率可达24%［8］。

我国每年产生大量的农作物秸秆。这些秸秆资源仅有很少部分作为动物饲料、人造板原料和食用菌栽培基质原料［9－10］，其余大部分资源被农民就地焚烧、四处堆放。这不仅造成生物资源的极大浪费，而且严重破坏生态环境［11］。秸秆中含有大量的木质素和纤维素，在常温下难以降解。因此，后续可以将分离获得的高温木质素分解中用于农作物秸秆的堆积发酵，从而快速、高效、无污染地处理农作物秸秆。

［1］李成翠，李术娜，朱宝成．高活性木质素降解菌株T-8的分离、筛选与鉴定［J］．河北农业大学学报，2010，33(6):57 －62．

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［3］冀珍芳，石淑兰．木质素的微生物降解［J］．广西轻工业，2002，15(1):4－5．

［4］曲音波．木质纤维素降解酶与生物炼制［M］．北京:化学工业出版社，2011．

［5］主巍，李秋菊，张英，等．木质素酶及其高产菌株选育的研究进展［J］．畜牧与饲料科学，2011，32(1):58 －60．

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［7］TUOMELA M，OIVANENL P，HATAKKA A．Degradation of synthetic 14C-lignin by various white-rot fungi in soil［J］．Soil biology ＆ biochemistry，2002，34(11):1613 －1620．

［8］任克中，张福元．木质素酶及其生产菌株选育的研究进展［J］．饲料与畜牧，2010(6):36 －39．

［9］蒋应梯，庄晓伟，王衍彬．利用农作物秸秆开发生物能源和有机肥初探［J］．生物质化学工程，2006，40(6):48 －50．

［10］袁玲，张宣，杨静，等．不同栽培方式和秸秆还田对水稻产量和营养品质的影响［J］．作物学报，2013，39(2):350 －359．

［11］席北斗，刘鸿亮，孟伟，等．垃圾堆肥高效复合微生物菌剂的制备［J］．环境科学研究，2003，16(2):58 －64．