条石鲷促性腺激素α亚基的克隆与表达特性分析
2015-03-18陈圣毅柳学周徐永江李晓晓王珊珊王妍妍
陈圣毅，史 宝，柳学周*，徐永江，李晓晓，王珊珊，王妍妍
(1.中国水产科学研究院 黄海水产研究所,山东 青岛 266071；2.农业部海洋渔业可持续发展重点实验室，山东 青岛 266071;3.上海海洋大学 水产与生命学院，上海 201306)
条石鲷促性腺激素α亚基的克隆与表达特性分析
陈圣毅1,2,3，史 宝1,2，柳学周1,2*，徐永江1,2，李晓晓1,2,3，王珊珊1,2，王妍妍1,2
(1.中国水产科学研究院 黄海水产研究所,山东 青岛 266071；2.农业部海洋渔业可持续发展重点实验室，山东 青岛 266071;3.上海海洋大学 水产与生命学院，上海 201306)
采用同源性克隆和cDNA末端快速扩增(RACE)方法，从条石鲷(Oplegnathidaefasciatus)垂体中获得了全长为897 bp的GtHα cDNA序列，其中包含249 bp的5′非编码区、399 bp的开放阅读框和249 bp的3′非编码区。该基因编码由132个氨基酸组成的前体蛋白，其中前38个氨基酸为信号肽，在第122和124Cys中间间隔了一个组氨酸(His)，形成CXC型趋化因子的特征结构，肽链中包括10个保守Cys残基和2个N-糖基化位点。氨基酸同源性和进化分析表明，条石鲷GtHα与鲈形目鱼类的进化关系较近，与鲈形目鱼类GtHα的同源性为87%～98%，与其他脊椎动物GtHα的同源性为53%～87%。实时荧光定量PCR检测发现，GtHα mRNA在垂体、脑、性腺中的表达量较高，在心、肝脏、胃、肠、肌肉、幽门盲囊中微量表达，在脾脏、头肾、鳃、肾脏中不表达，其中在垂体中的表达量最高；周期表达发现：垂体中GtHα mRNA在卵巢发育的Ⅴ期达到最大值，卵巢中GtHα mRNA在卵巢发育的Ⅳ期达到最大值，而脑组织中GtHα mRNA在卵巢发育的Ⅴ期达到最低值，表明GtHα对卵母细胞发育的调控可能同时通过自分泌和旁分泌两种途径进行。本研究为条石鲷生殖调控机制及人工繁育技术研究提供了基础资料。
条石鲷；促性腺激素α亚基；cDNA克隆；表达；卵巢发育周期
鱼类的生殖活动主要受到下丘脑-脑垂体-性腺轴的调控，其中促性腺激素(Gonadotropin Hormone，GtH)起着重要的调控作用。GtH是由脑垂体中促性腺激素细胞分泌的一种糖蛋白激素，对性类固醇激素的分泌、生殖周期的启动以及生殖细胞的产生、成熟、排放等过程起着重要的调节作用[1-3]。在哺乳动物中，存在两种类型的GtH，分别是促滤泡激素(Follicle-stimulating Hormone, FSH)和促黄体激素(Luteinizing Hormone，LH)。FSH、LH、促甲状腺激素(Thyroid-stimulating Hormone，TSH)和绒毛膜促性腺激素(Chorionic Gonadotropin，CG)都是GPHs家族的成员[4]，所有的GPHs都由2个不同的α亚基和β亚基组成，其中α亚基在4种激素中都是相同的，而β亚基具有种的特异性，只有2个亚基结合在一起才能发挥特定的生物学活性[5]。GtHα在整个脊椎动物中是高度保守的，它在卵子的产生、成熟、排放以及类固醇激素信号传导方面发挥着重要作用[6]。目前，已从青鱼(Mylopharyngodonpiceus)[7]、鲫鱼(Carassiusauratus)[8]、斑马鱼(Daniorerio)[9]、大麻哈鱼(Oncorhynchusketa)[10]、银大马哈鱼(Oncorhynchuskisutch)[11]、半滑舌鳎(Cynoglossussemilaevis)[12]、鲤鱼(Cyprinuscarpio)[13]、鳙鱼(Hypophthalmichthysnobilis)[14]、西伯利亚鲟(Acipenserbaerii)[15]、团头鲂(Megalobramaamblycephala)[16]、草鱼(Ctenopharyngodonidellus)[17]等多种硬骨鱼脑垂体中分离出2种GtH。
条石鲷(Oplegnathidaefasciatus)隶属于鲈形目(Perciformes)，石鲷科(Oplegnathidae)，石鲷属(Oplegnathus)[18]，在我国黄海、东海和台湾沿海等海域均有分布。条石鲷肉质细嫩、口感独特、体色艳丽，具有很高的营养价值和观赏价值，条石鲷还适合网箱、池塘、工厂化等多种养殖模式，是一种理想的增养殖鱼种。我国自21世纪初开始条石鲷人工繁育技术研究，并先后对条石鲷的形态学、成鱼消化道结构特征、胚胎和仔稚鱼形态特征以及人工养殖条件等进行了研究，促进了条石鲷养殖业的发展[19-20]。近年来，对条石鲷的繁殖生物学和人工繁育技术进行了深入的研究，促进了条石鲷养殖业的发展，但是关于条石鲷繁殖内分泌学方面的研究报道并不多见。本研究克隆了条石鲷GtHα全长，对其cDNA序列进行了同源性比较和系统进化分析，同时分析了GtHα的表达特性，为条石鲷生殖内分泌机制研究提供了基础资料，也为下丘脑多肽激素如促性腺激素释放激素(Gonadotropin-releasing hormone，GnRH)调控GtHα mRNA表达和信号传导通路的研究奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
条石鲷取自青岛忠海水产有限公司(2012-04—12)，共取人工培育的3龄以上性成熟的条石鲷雌鱼(全长27.23～31.11 cm，体重478.2～671.7 kg)16尾。条石鲷培育水温15～26 ℃，盐度28～32，pH 8.0～8.2，溶解氧6 mg/L以上，日换水率300%～500%。
1.2 样品采集
分别于2012-04，2012-05，2012-06，2012-08完成条石鲷亲鱼取样，每次取样4尾。实验鱼活体打包充氧运回实验室，用MS222(200 mg/L)麻醉后解剖，取其脑、垂体、卵巢、心脏、胃、幽门盲囊、肠、脾脏、肾脏、鳃、肌肉、肝脏组织快速投入液氮(-196 ℃)中，后转入-80 ℃冰箱保存，用于总RNA的提取。同时，用Davidson固定液固定部分卵巢组织，24 h后转入70%的酒精保存，用于组织学观察，确定卵巢发育时期。
1.3 卵巢的组织学分析
卵巢组织通过梯度酒精(70%～100%)脱水、二甲苯透明、石蜡包埋后利用LEICA RM 2235型切片机切成6 μm切片，烘干后H.E染色，中性树脂封片，在显微镜(NIKON 90i)下观察、拍照。卵巢各发育期的确定参考刘筠等[21]的分类方法。
1.4 RNA提取
利用RNAiso Plus (TaKaRa)从垂体、心脏、卵巢等13个组织中提取总RNA。利用超微量紫外检测仪(Nanodrop 2000D)检测总RNA的纯度和浓度，1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量。
1.5 条石鲷GtHα cDNA核心序列的克隆
根据NCBI上已报道的其他鲈形目鱼类的GtHα全长序列设计了特异性引物(表1)。以条石鲷垂体总RNA为模板，根据PrimeScript®RT-PCR Kit反转录试剂盒(TaKaRa)中的操作说明反转录合成cDNA。然后用GtHα特异性引物扩增GtHα核心序列，PCR条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，59.8 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s共30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经1%的琼脂糖电泳检测、切胶回收、纯化后连接到pEASY-T1载体(北京全式金生物技术有限公司)上并转移至Trans1-T1感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)中，37 ℃条件下振荡培养12～14 h，筛选阳性克隆菌株送至华大基因公司测序。将测序结果在NCBI上进行分析比对。
1.6 条石鲷GtHα cDNA的5′-RACE和3′-RACE
根据克隆得到的条石鲷GtHα cDNA核心序列设计了GtHα的RACE引物(表1)，以垂体总RNA为模板，根据Clontech SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit 反转录试剂盒(TaKaRa)中的操作说明分别合成5′-cDNA和3′-cDNA。然后分别以5′-cDNA和3′-cDNA为模板，以GtHα-outGSP5和GtHα-outGSP3为引物，根据Smart RACE Advantage 2 PCR 试剂盒(Clontech)中的操作说明进行PCR扩增，PCR条件：94 ℃ 30 s; 68 ℃ 30 s, 15个循环,Tm每个循环降低0.5 ℃, 72 ℃延伸2 min; 然后94 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 60 s, 28个循环。
将第一次PCR产物稀释40倍后作为模板，分别以GtHα-NGSP5和GtHα-NGSP3为引物进行巢式PCR，PCR条件同第一次PCR。用1%的琼脂糖电泳检测PCR产物,然后切胶回收、连接转化、筛选阳性克隆并测序。
表1 实验中所用的主要引物
1.7 序列分析
测序结果在NCBI数据库中利用BLAST进行同源性比对。利用DNAstar软件进行序列拼接、预测蛋白分子量和等电点；利用ExPASy中的Translate Tool进行氨基酸序列翻译；利用SignalP 4.0 Server进行信号肽预测；利用Clustal X进行氨基酸同源性比较；利用MEGA 5.0中的Neighbor-joining法(自展值为1 000)进行分子进化分析；利用SOPMA进行蛋白质二级结构预测；利用I-TASSER进行蛋白质三级结构预测。
1.8 条石鲷GtHα基因的组织表达与周期表达
采用实时荧光定量PCR法(Mastercycler®eprealplex实时荧光定量PCR仪)检测GtHα mRNA在条石鲷不同组织中的相对表达量和在卵巢发育不同时期中脑、垂体、性腺组织中的表达水平变化。根据1.6得到条石鲷GtHα cDNA全序列，设计特异性引物Q-GtHα F1和Q-GtHα R1，以Q-β-actin F和Q-β-actin R作为内参引物(表1)，用SYBR GreenⅡ荧光染料(TaKaRa)进行荧光定量检测，用比较阈值法测定不同组织的相对表达量。每种组织取3尾鱼，每尾鱼设定3个平行。
以各组织RNA为模板，根据PrimeScript®RT reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒(TaKaRa)中的操作说明合成cDNA。Real-time PCR程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s；57.5 ℃ 28 s，共40个循环，反应结束后进行溶解曲线分析。
根据Ct值计算引物的扩增效率并进行溶解曲线的分析，以确定引物和扩增参数是否达到进行荧光定量检测组织相对表达量的要求(0.8
2 结果与分析
2.1 条石鲷卵巢各发育时期的特征
对各实验组的雌性条石鲷卵巢进行组织切片观察,确定其性腺发育时期：1)在4月份，卵母细胞体积增大，卵细胞多为圆形，细胞核嗜碱性，核仁多靠近核膜分布。初期近细胞膜细胞质内出现数量不等的液泡，其数目和大小随着卵母细胞的生长而增加，并逐渐向核中央靠近。以Ⅲ时相卵母细胞为主的卵巢称为Ⅲ期卵巢(图1a)。2)5月份，卵母细胞随着营养物质的不断积累，细胞体积继续增大，胞质中储存着大量卵黄颗粒和油球。卵母细胞外有两层滤泡细胞，随着发育的进行，放射带越来越模糊，并且逐渐缩小，以Ⅳ时相卵母细胞为主的卵巢称为Ⅳ期卵巢(图1b)。3)6月份，卵母细胞呈圆球形，直径可以达到326.1～370.2 μm。由于卵黄颗粒的大量积累和融合，此时的核仁已经消失，卵母细胞已经脱离滤泡膜进入卵巢腔，以Ⅴ时相卵母细胞为主的卵巢称为Ⅴ期卵巢(图1c)。4)8月份，由于亲鱼刚刚产完卵，卵巢萎缩，呈皱缩厚后囊状，卵巢壁上的平滑肌纤维松弛，厚度明显增加。此时相的卵母细胞呈圆球形，卵黄颗粒已经相互融合，核膜消失，此时为Ⅵ期卵巢(图1d)。
图1 条石鲷卵巢发育不同时期的形态图Fig.1 The morphological characteristicsin ovarian development stages of female Oplegnathus fasciatus
2.2 条石鲷GtHα的序列分析和蛋白质结构预测
条石鲷GtHα cDNA全长为897 bp，编码132个氨基酸，包括1个399 bp开放阅读框、1个249 bp的5′非编码区和一个249 bp的3′非编码区，在Genbank注册号为KM507036。第1～38个氨基酸为信号肽，第39～132个氨基酸为成熟肽。成熟肽序列包含了10个保守的Cys残基，分别位于第49，52，69，72，73，100，101，122，124，127氨基酸残基处，在第122和124Cys残基中间间隔了1个His，形成CXC型趋化因子的特征结构(图2)。此外，在GtHα氨基酸序列中发现了2个N-糖基化位点(NIT)和(NHT)(图3)，在3′端非编码区内含有1个加尾信号ATTAAA(图2)。
通过SOPMA软件进行蛋白质结构分析显示，在GtHα蛋白质的二级结构中，α-螺旋占41.67%，β-转角占4.55%，无规则卷曲占40.15%，延伸链占13.64%(图3)。通过I-TASSER软件预测了条石鲷GtHα蛋白质的三级结构(图4)。结果表明存在典型的CXC趋化因子的空间结构，它包含1个N末端环状结构(loop)，3个反向平行的β链以及1个C末端的α螺旋。该蛋白的分子量为14.59 kDa，等电点为8.41。
注：黑色阴影部分表示起始密码子；方框部分表示终止密码子；下划线部分表示加尾信号；椭圆部分表示10个半胱氨酸图2 条石鲷GtHα cDNA全长以及推断的氨基酸序列Fig.2 The cDNA sequence and its deduced amino acid sequence of gonadotropin hormone common-alpha subunit from Oplegnathus fasciatus
图4 I-TASSER软件对条石鲷GtHα蛋白三级结构的分析结果Fig.4 Tertiary structure of Oplegnathus fasciatus GtHα protein analyzed by I-TASSER
2.3 条石鲷GtHα氨基酸的同源性比较及系统进化分析
将条石鲷的GtHα氨基酸序列与其他物种的GtHα氨基酸序列进行同源性比较，结果表明：条石鲷的GtHα与鲈鱼(Dicentrarchuslabrax)的同源性最高，为98%；与鲈形目真鲷(Pagrusmajor)、棘池蝶蚌(Acanthopagrusschlegelii)、条纹鲈(Moronesaxatilis)、花鲈(Lateolabraxjaponicus)、斜带石斑鱼(Epinepheluscoioides)、罗非鱼(Oreochromisniloticus)、小丑鱼(Amphiprionmelanopus)的同源性分别为96%，94%，94%，97%，97%，87%，87%；与其他脊椎动物GtHα氨基酸序列的同源性在53%～87%(图5)。
通过MEGA5.0软件构建了条石鲷GtHα氨基酸序列的NJ系统进化树。结果表明：条石鲷与鲈形目鱼类的亲缘关系较近，与硬骨鱼类构成一个大分支，与鲈鱼和条纹鲈聚为1个小分支，这与上述Blast的分析结果一致(图6)。
注：细框部分代表半胱氨酸残基位点；粗框部分代表N-糖基化位点图5 条石鲷GtHα氨基酸序列与其他物种GtHα氨基酸序列的比较Fig.5 Amino acid sequence alignment of gonadotropin hormone common-alpha subunit from Oplegnathus fasciatus with other species
注：条石鲷用直线标出图6 条石鲷GtHα氨基酸序列与其他脊椎动物GtHα的系统进化树Fig.6 Phylogenetic tree based on the amino acid sequences of GtHα, showing the relationship between Oplegnathus fasciatus and other known vertebrates
2.4 条石鲷GtHα在不同组织中的表达分布
采用Real time PCR法，以β-actin基因为内参，检测GtHα mRNA在条石鲷不同组织中的表达分布情况。结果表明：GtHα mRNA在除脾脏、头肾、鳃、肾脏的所有组织都有表达，但在表达量上有明显差异，GtHα mRNA在垂体中的表达量与其他组织差异极显著(P<0.01)。而GtHα mRNA在脑和性腺的表达量相对于心、肝脏、胃、肠、肌肉、幽门盲囊差异显著(P<0.05)，而在胃、幽门盲囊、肠、和肌肉之间的表达差异不显著(P>0.05)。
2.5 GtHα在条石鲷卵巢发育不同时期的表达水平
利用荧光定量PCR法检测了GtHα在雌性条石鲷卵巢发育不同时期垂体、卵巢、脑中的相对表达水平。与脑和性腺相比，垂体中的GtHα mRNA在卵巢发育各个时期都有较高的表达水平。利用SPSS 16.0软件显著性检验分析得出，GtHα mRNA在各繁殖周期垂体、脑、卵巢组织的表达水平差异显著(P<0.05)。
在垂体组织中，GtHα mRNA在Ⅲ～Ⅴ期的相对表达量逐渐上升，到Ⅴ期时达到最高水平，到Ⅵ期时显著下降(图8)；在卵巢组织中，GtHα mRNA在Ⅲ～Ⅳ期的相对表达量急剧上升，到Ⅳ期时达最高水平，在Ⅴ期又急剧下降，达到最低值，在Ⅵ期又开始慢慢回升(图8)；在脑组织中，GtHα mRNA在Ⅲ～Ⅴ期的相对表达量逐渐下降，到Ⅴ期时达最低水平，并明显低于其他发育期水平，之后在Ⅵ期时又开始上升(图9)。
注：P：垂体；B：脑；O：卵巢；Sp：脾；HK：头肾；G：鳃；St：胃；L：肝脏；PC：幽门盲囊；I：肠；H：心脏；K：肾；M：肌肉图7 条石鲷GtHα mRNA在不同组织中的相对表达水平Fig.7 The relative expression level of GtHα mRNA in various tissues of Oplegnathus fasciatus
注：Ⅲ：Ⅲ期卵巢；Ⅳ：Ⅳ期卵巢；Ⅴ：Ⅴ期卵巢；Ⅵ：Ⅵ期卵巢；凡无相同字母表示差异显著(P<0.05)图8 卵巢和垂体中GtHα mRNA在条石鲷卵巢不同发育时期的相对表达量Fig.8 The relative expression of GtHα mRNA of ovarian and pituitary in different ovarian development stage of Oplegnathus fasciatus
注：Ⅲ：Ⅲ期卵巢；Ⅳ：Ⅳ期卵巢；Ⅴ：Ⅴ期卵巢；Ⅵ：Ⅵ期卵巢；凡无相同字母表示差异显著(P<0.05)图9 脑中GtHα mRNA在条石鲷卵巢不同发育时期的相对表达量Fig.9 The relative expression of GtHα mRNA of brain in different ovarian development stage of Oplegnathus fasciatus
3 讨 论
利用RT-PCR和RACE法从条石鲷垂体中扩增出了全长897 bp的GtHα cDNA序列。序列分析发现，在其成熟肽序列中存在10个保守的Cys和2个N-糖基化位点，这些保守部分可能参与了促性腺激素亚型和受体结合[22]。系统进化树分析发现，条石鲷与多数鲈形目鱼类在1个分支节点上，这与形态学上得出的分类进化地位相一致。此外，还发现GtHα在硬骨鱼类和哺育动物中高度保守，这可能是因为所有脑垂体中的糖蛋白类激素都可以与其结合，GtHα在较高的进化选择压力下形成了保守的结构。本研究从条石鲷脑垂体中克隆到1种GtHα，这与莫桑比克罗非鱼(Oreochromismossambicus)[23]和中华鲟(Acipensersinensis)[24]均只有1种GtHα亚基的报道一致。
采用实时定量荧光PCR方法检测了GtHα在各组织中的相对表达水平。结果发现GtHα mRNA主要在垂体中表达，该特征与其他硬骨鱼类的相同[25]，表明垂体是其主要分泌的部位；研究还发现GtHα mRNA在脑、性腺中的表达量较低，在心脏、肝脏、胃、肠、肌肉、幽门盲囊中微量表达，这种多组织表达特性暗示GtHα除通过垂体分泌参与卵母细胞的发育成熟调控之外，还可能有更为广泛的生理功能。Mittelholzer等[26]采用实时荧光定量PCR方法检测到大西洋鳕鱼(Gadus morhua)的GtHα mRNA在垂体、脑、性腺、肝脏和鳃中表达；但是在检测的心、头肾、肌肉、肠、脾脏中没有发现GtHα mRNA的表达。一些学者运用RT-PCR和免疫细胞化学染色法证明了GtHα在一些鱼类[27-28]、哺乳动物(包括人类)[29]垂体之外的组织中存在着表达。GtHα lpha在不同组织的表达特征，说明了促性腺激素存在多种调控机制。
采用Real Time PCR法检测了GtHα在条石鲷卵巢发育不同时期表达水平变化。结果发现：条石鲷垂体中的GtHα mRNA在Ⅴ期达到最大值，表明GtHα在卵黄生成和卵母细胞成熟阶段发挥作用，这与雌性鲑科鱼周期表达的结果相一致[30]。Santos等[31]在研究虹鳟(Oncorhynchusmykiss)时也发现GtHⅠmRNA的表达量在卵黄形成阶段逐步上升，在即将排卵时，垂体中GtHⅡ的浓度急剧增大，达到最大值，表明GtH Ⅰ和GtHⅡ在虹鳟生殖的不同时期有不同程度的合成与分泌，因而对性腺的发育和配子的产生起着不同的生理功能。Shimizu等[32]在研究底鳉(Fundulusheterocliutus)时发现产卵期垂体中2种GtH细胞都很丰富，表明卵母细胞的最终成熟需要2种GtH的参与。对于GtHα在条石鲷生殖周期垂体中的这种表达特性是否是由垂体中GtHⅡ的大量分泌而引起的，以及调控GtHα在条石鲷生殖周期垂体中表达量不同的具体机理还有待进一步研究。
本研究还发现，卵巢中GtHα mRNA表达水平在Ⅳ期达到最大值，而在Ⅴ期达到最低值，这可能暗示着GtHα mRNA直接参与了卵黄的早期发育。GtH是性腺产生性激素的主要调控者：一方面，垂体分泌的GtH通过血液迁移到性腺中，与其受体GtHR结合以促进性腺成熟；另一方面，GtH可能是通过调节芳香化酶基因的表达和芳香化酶的活性来刺激卵巢自身分泌雌二醇进一步来调节性腺的发育、配子的生成以及卵母细胞的最后成熟[33]。Liu等[34]在研究罗非鱼(Oreochromismossambicus)时也发现卵巢中GtHα mRNA在Ⅳ期达到最大值，表明卵巢中GtHα mRNA可能在鱼类生殖、细胞增殖以及早期卵巢分化和成熟中发挥重要作用。这些结果表明条石鲷的内分泌调节系统可能具有更为复杂的作用模式。此外，关于GtH对鱼类生殖调控的内部机制以及GtH自身分泌调控的内部机制问题，仍需要进一步研究和探讨。
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Received: March 5, 2014
Cloning and Expression Pattern of Gonadotropin Hormone Common-alpha Subunit inOplegnathusfasciatus
CHEN Sheng-yi1,2,3, SHI Bao1,2, LIU Xue-zhou1,2*,XU Yong-jiang1,2,LI Xiao-xiao1,2,3, WANG Shan-shan1,2, WANG Yan-yan1,2
(1.YellowSeaFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Qingdao 266071,China;2.KeyLaboratoryofSustainableDevelopmentofMarineFisheries,MinistryofAgriculture,QingdaoKeyLaboratoryforMarineFishBreedingandBiotechnology, Qingdao 266071,China;3.CollegeofFisheriesandLifeScience,ShanghaiOceanUniversity, Shanghai 201306,China)
A full length cDNA sequence of gonadotropin hormone common alpha subunit was cloned from the pituitary of Oplegnathus fasciatususing by homology cloning and RACE techniques. The GtHα cDNA sequence consisted of 897 base pairs nucleotides, including 249 base pairs at 5′ untranslation region, 249 base pairs at 3′ untranslation region and an open reading frame with 399 base pairs nucleotides. The cDNA sequence encoded a precursor protein of 132 amino acids preceded by a signal peptide of 38 amino acids residues. The putative peptide contained ten cysteine residues and two N-glycosylation sites residues. A histidine residue in the middle of 122 and 124 cysteine formed a CXC chemokine characteristic structure. Sequences comparison and phylogenetic analysis showed that the GtHα ofOplegnathusfasciatushad higher identity to their orthologs of Perciformes (87%～98%) than to other vertebrates (53%～87%). The qRT-PCR results suggested that the level of GtHα mRNA was higher in pituitary, ovary, brain and trace expression in heart, liver, stomach, intestine, muscle and pyloric caecum.However, it was not found in kidney, Head kidney, spleen and gill by Real-time Quantitative PCR technique. The level of GtHα mRNA was highest in pituitary. The reproductive cycle expression showed that the level of GtHα mRNA in pituitary was maximum in the stage Ⅴ of ovarian development and that in ovary was maximum in the stage Ⅳ. However, the level in brain was lowest in the stage Ⅴ suggesting the regulation of GtHα in the ovarian development may through both autocrine and paracrine pathways. This research provides a reference to the reproductive regulation mechanism and artificial breeding technigues ofOplegnathusfasciatus.
Oplegnathusfasciatus；gonadotropin hormone common-alpha subunit；molecular cloning; expression; ovarian development cycle
2014-03-05
国家高技术研究发展计划——新养殖海水种类苗种繁育技术(2012AA10A413)；国家自然科学基金——半滑舌鳎膜孕激素受体(mPR-like)及其对卵母细胞成熟过程的作用 (31201982) ；山东省优秀中青年科学家科研奖励基金——孕酮受体膜组分1在半滑舌鳎卵巢发育成熟过程中的作用 (BS2013SW042)
陈圣毅(1988-) ，男，湖北武汉人，硕士研究生，主要从事鱼类繁殖生理学方面研究.E-mail:shengyichen88@163.com
*通讯作者：柳学周(1959-)，男，山东青岛人，研究员，主要从事鱼类繁育理论与增养殖技术方面研究.E-mail: liuxz@ysfri.ac.cn
(王佳实 编辑)
Q418
A
1671-6647(2015)02-0207-12
