姜黄素对大鼠脑缺血再灌注损伤炎症反应和血脑屏障通透性的作用研究

李 冠，夏 振

(1. 湖北省襄阳市中心医院，湖北 襄阳 441021；2. 山东省医学科学院附属医院，山东 济南 250031)

姜黄素对大鼠脑缺血再灌注损伤炎症反应和血脑屏障通透性的作用研究

李 冠1，夏 振2

(1. 湖北省襄阳市中心医院，湖北 襄阳 441021；2. 山东省医学科学院附属医院，山东 济南 250031)

目的 探讨姜黄素对大鼠脑缺血再灌注损伤炎症反应和血脑屏障通透性的作用，为姜黄素的应用提供一定的理论依据。方法 选取40只雄性SD大鼠，随机分为对照组、模型组、姜黄素低剂量组以及姜黄素高剂量组。除对照组外,其他3组采用线栓法制作大鼠脑缺血再灌注损伤模型。在制作缺血模型前15 min，姜黄素低剂量组给予10 mg/kg姜黄素制剂腹腔注射，姜黄素高剂量组给予50 mg/kg姜黄素制剂腹腔注射，模型组给予相同体积的玉米油腹腔注射。手术后24 h对所有大鼠进行神经功能评分，然后断头取脑组织进行脑组织髓过氧化物酶、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、MMP-9和伊文思蓝容量水平、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、NF-κB p65水平测定及脑梗死体积的测定。结果 模型组、姜黄素低剂量组以及姜黄素高剂量组的脑组织髓过氧化物酶活性、神经功能损伤评分、脑梗死体积、MMP-2、MMP-9、伊文思蓝容量、TNF-α和NF-κB p65均显著高于对照组(P均<0.05),而姜黄素低剂量组及姜黄素高剂量组均显著低于模型组(P均<0.05)，且姜黄素高剂量组优于姜黄素低剂量组(P<0.05)。结论 姜黄素能够明显改善大鼠脑缺血再灌注引起的损伤，其药效机制可能与抑制NF-κB、TNF-α、MMP-2和MMP-9蛋白表达有关系。

姜黄素；脑缺血再灌注损伤；血脑屏障

随着人类生活方式的改变，脑血管疾病发病率呈逐年上升趋势，且此类疾病致死、致残率高，严重威胁人类生命健康。临床统计数据显示：80%脑血管疾病属于缺血性病变[1]，除缺血本身外，缺血恢复血供后大量自由基聚集、过度炎性反应等系列复杂的病理过程都会使脑组织发生继发性损伤，从而进一步加重脑组织的免疫炎症反应、血管源性水肿和出血，破坏血脑屏障[2]。近年来研究发现，许多中药提取物或复方对缺血性脑血管疾病和继发损伤有很好的治疗效果，但对其中大多数药物的药效机制不甚明确。笔者以脑缺血再灌注损伤大鼠为模型动物，对中药提取物姜黄素对脑缺血再灌注损伤炎症反应和血脑屏障的作用机制进行了研究，现将结果报道如下。

1 实验资料

1.1主要试剂和动物

1.1.1主要试剂 选择南京广润生物制品有限公司所研制的高纯度姜黄素，使用0.5 mol/L的氢氧化钠进行溶解，将其稀释为100 g/L的溶液，冷藏在-20 ℃的环境中，在实验中根据实际情况再次进行稀释。伊文思蓝染料购自上海恒远生物科技有限公司，脑组织髓过氧物酶试剂盒、兔抗鼠基质金属蛋白酶-2(MMP-2)多克隆抗体、兔抗大鼠MMP-9多克隆抗体、鼠抗大鼠β-actin单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。肿瘤坏死因子α(TNF-α)ELISA试剂盒购自美国RD公司，NF-κB p65多克隆抗体、免疫组化二抗染色试剂盒、DAB显色试剂盒购自武汉博士德公司。

1.1.2实验动物 SD大鼠，雄性，共40只，体质量250～300(270±20)g,由山东中医药大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK(鲁)20110002。

1.2实验方法

1.2.1动物分组 将实验大鼠按照随机数字法分为对照组、模型组、姜黄素低剂量组以及姜黄素高剂量组，每组10只。

1.2.2脑缺血模型的制备 除对照组外,其他3组采用线栓法制作大鼠脑缺血再灌注损伤模型。方法：腹腔麻醉后，分离颈总动脉套线，电针灼烧双侧椎动脉，缝合后24 h于颈部正中切口，同时夹闭双侧颈总动脉，造成脑缺血状态20 min，然后松开双侧动脉夹恢复脑血流灌注，对照组除不夹闭双侧颈总动脉外，其余操作与另外3组一致。在制作缺血模型前15 min，姜黄素低剂量组给予10 mg/kg姜黄素制剂(药物用玉米油稀释至10 mg/mL)腹腔注射，姜黄素高剂量组给予50 mg/kg姜黄素制剂(药物用玉米油稀释至50 mg/mL)腹腔注射，模型组给予相同体积的玉米油腹腔注射。

1.3观察指标及测量方法 全部大鼠于手术后23 h经尾静脉注射伊文思蓝，24 h大鼠清醒后，首先对所有大鼠进行神经功能评分，然后将大鼠麻醉后固定于手术台上，剪开右心耳同时向左心室注入4 ℃肝素钠，待右心耳流出清澈液体时表示灌注完成。断头取出大鼠脑组织，将大鼠大脑部分受损区域分离剪碎放入离心管中，滴加PBS后以4 500 r/min离心10 min后，取匀浆备用。另一部分受损脑组织通过切片染色进行脑梗死体积的测定。

1.3.1脑组织髓过氧化物酶检测 取上述匀浆100 mg，按照脑组织髓过氧化物酶试剂的说明书具体步骤进行操作，即可算出脑组织髓过氧化物酶活性[2]。

1.3.2MMP-2、MMP-9水平测定 取上述匀浆100 mg，经过蛋白裂解后提取总蛋白，通过灌胶、上样、电泳、转膜、封闭后，加入一抗(兔抗大鼠MMP-9多克隆抗体、鼠抗大鼠β-actin 单克隆抗体)4 ℃孵育过夜，再加入二抗室温孵育2 h，发光得到MMP-2、MMP-9 Western blot结果。

1.3.3伊文思蓝容量水平测定 取上述匀浆100 mg，与50%的三氯醋酸均匀混合，静置24 h，紫外分光光度法测定出伊文思蓝溶液的具体数值，并绘制出标准曲线，可以根据标准曲线的相关数据计算出伊文思蓝容量水平。

1.3.4TNF-α和NF-κB p65水平测定 取上述匀浆100 mg，采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定同一时间点大鼠缺血脑组织的TNF-α水平，采用Western blot方法测定NF-κB p65水平。

1.3.5脑梗死体积测定 取出大鼠的部分受损脑组织，根据管状面组织进行大脑切片，厚度保持在2 mm。将其放入TTC染色液中静置20 min，20 min后再将大脑切片放置在10%福尔马林溶液中静置24 h。如果是正常的脑组织颜色为鲜红色，脑梗死的脑组织颜色为白色。使用IPP图像分析软件具体测量出每一片大脑切片的梗死面积，从而计算整个大脑的脑梗死体积。

1.4神经功能损伤评分标准 无神经功能障碍为0分；抓起大鼠的尾巴，如果其前肢弯曲计1分；行走过程中在地上不停打转，停止后身体不偏向对侧计2分；行走过程中在地上不停打转，停止后身体偏向对侧计3分；严重意识障碍计4分。

2 结 果

2.1各组脑组织髓过氧化物酶活性、神经功能损伤评分和脑梗死体积比较 模型组、姜黄素低剂量组以及姜黄素高剂量组脑组织髓过氧化物酶活性、神经功能损伤评分和脑梗死体积均显著高于对照组(P均<0.05)；姜黄素低剂量组以及姜黄素高剂量组脑组织髓过氧化物酶活性、神经功能损伤评分和脑梗死体积均显著低于模型组(P均<0.05)，且姜黄素高剂量组低于姜黄素低剂量组(P<0.05)。见表1。

表1 各组脑组织髓过氧化物酶活性、神经功能损伤评分和脑梗死体积比较

注：①与对照组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05；③与姜黄素低剂量组比较，P<0.05。

2.2各组MMP-2、MMP-9和伊文思蓝容量水平比较 模型组、姜黄素低剂量组以及姜黄素高剂量组MMP-2、MMP-9和伊文思蓝容量水平均显著高于对照组(P均<0.05)；姜黄素低剂量组以及姜黄素高剂量组MMP-2、MMP-9和伊文思蓝容量水平均显著低于模型组(P均<0.05)，且姜黄素高剂量组低于姜黄素低剂量组(P<0.05)。见表2。

表2 各组MMP-2、MMP-9和伊文思蓝容量水平比较

注：①与对照组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05；③与姜黄素低剂量组比较，P<0.05。

2.3各组TNF-α和NF-κBp65水平比较 模型组、姜黄素低剂量组以及姜黄素高剂量组TNF-α和NF-κBp65水平均显著高于对照组(P均<0.05)；姜黄素低剂量组以及姜黄素高剂量组TNF-α和NF-κBp65水平均显著低于模型组(P均<0.05)，且姜黄素高剂量组低于姜黄素低剂量组(P<0.05)。见表3。

表3 各组TNF-α和NF-κB p65水平比较

注：①与对照组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05；③与姜黄素低剂量组比较，P<0.05。

3 讨 论

缺血性脑血管病及再灌注损伤是一种高致死、致残性疾病，患者多数预后不良，对患者生活质量造成严重影响，不仅给患者带来极大的身心创伤，也给家庭和社会带来沉重负担。缺血性脑血管病治疗的关键是在尽早恢复脑组织正常供血的同时减少或避免再灌注损伤脑组织带来的二次创伤[3-4]。当前对脑缺血再灌注损伤的发病机制研究结果有氧自由基聚集、细胞信号转导过度、线粒体损伤、免疫炎症等学说[5]，其中过度炎性反应被认为是损伤产生的重要原因。NF-κB是炎症反应过程的信号转导因子，作用于炎症的中心环节，在脑缺血再灌注损伤中受氧自由基、钙超载等因素刺激活化后，迅速从细胞浆移位进入细胞核内，结合启动子序列上特异位点，从而启动炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1的转录。TNF-α是发生脑缺血再灌注时受损脑细胞和浸润的免疫细胞分泌的细胞因子之一，它通过介导神经细胞凋亡、促进星形胶质细胞中ICMA-1和主要组织相容性复合物Ⅱ类分子的表达、促进白细胞浸润和血脑屏障破坏对神经元细胞造成损伤；有研究通过小鼠TNF-α基因敲除后进行脑缺血再灌注实验证明，敲除该基因的小鼠脑组织梗死体积明显比对照组小，这说明TNF-α可能有神经毒害作用[6]。

血脑屏障损伤发生于脑缺血再灌注后，血脑屏障正常通透性发生异常进而引发脑水肿。MMPs是一类能够降解细胞外基质(ECM)的蛋白质，它们是锌离子依赖的蛋白酶，能够降解多种细胞外基质成分[7]。MMP-2和MMP-9是MMPs蛋白质家族2种十分重要的酶，通过直接降解蛋白破坏血脑屏障[8-9]。对MMP-2和MMP-9与缺血性脑损伤后血脑屏障的破坏关系的研究报道证明，大量的MMP-2和MMP-9表达在缺血性脑损伤患处表达，而上述两种酶在外周血和未受损部位表达则无异常，而通过应用MMPs抑制剂和基因沉默方式发现抑制MMPs对脑再灌注损伤有重要的治疗作用[10-11]。

姜黄素是一种从姜黄属药用植物中提取的黄颜色多酚物质，其有多种生物学功能，包括清除自由基、抗肿瘤、抗细胞凋亡、抗氧化和抗炎症等作用。纪风涛等[12]报道，姜黄素可减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后的脑梗死体积和脑水肿程度，改善大鼠的行为学评分。杨克红等[13]研究发现姜黄素能够通过增加脑缺血再灌注损伤脑组织中脑源性神经营养因子(BDNF)及原肌球蛋白受体激酶B(TrkB)蛋白表达，增加BDNF蛋白合成及其与其特异性受体TrkB相结合量，产生对缺血神经元起保护作用的效应分子，从而发挥对脑缺血再灌注损伤的保护作用。本研究发现，脑缺血再灌注损伤24h后，模型组、姜黄素低剂量组以及姜黄素高剂量组大鼠脑组织髓过氧化物酶活性、神经功能损伤评分、脑梗死体积，TNF-α、NF-κBp65、MMP-2、MMP-9和伊文思蓝容量水平均显著高于对照组，黄素低剂量组以及姜黄素高剂量组各指标均显著低于模型组，且随着剂量升高效果更加明显，说明缺血再灌注造成一定的炎症反应和血脑屏障损伤，而姜黄素可以使脑缺血再灌注后受损脑组织炎性反应程度、血脑屏障损伤程度降低。

综上所述，姜黄素能够明显改善大鼠脑缺血再灌注引起的损伤，其药效机制可能与抑制NF-κB、TNF-α、MMP-2和MMP-9蛋白表达有关系。

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Study on the effect of ourcumin on inflammation actions and blood-brain barrier permeability in rats with cerebral ischemia/reperfusion injury

LI Guan1, XIA Zhen2

(1.The Central Hospital of Xiangyang City, Xiangyang 441021, Hubei, China; 2.The Affiliated Hospital of Medical Science Academy of Shandong Province, Jinan 250031, Shandong, China)

Objective It is to analyze and discuss the effect of curcumin on inflammation actions and blood-brain barrier permeability in rats with cerebral ischemia/reperfusion injury, thus to provide a theoretical basis for the applications of this medicine. Methods 40 male SD rats were selected and randomly divided into control group, model group, low and high dosage of curcumin groups. The rats in all the groups except control group were made into ischemia/reperfusion injury models by suture method. At 15min before model establishing, low and high dosage of curcumin groups were respectively given 10 mg/kg and 50 mg/kg curcumin by intraperitoneal injection, model group was given the same volume of maize oil by intraperitoneal injection. In 24 hours after cerebral ischemia neurological severity scores of all the rats were evaluated, then the heads of the rats were cut off and and brain tissue was gotten to determine the levels of myeloperoxidase,matrix metalloproteinase-2 (MMP-2), MMP-9 and Evans Blue capacity, TNF-α and NF-κB p65, neurological damage score and infarct volume were evaluated too. Results Myeloperoxidase activity, neurological injury score, infarction volume, MMP-2, MMP-9, Evans Blue capacity, TNF-α and NF-κB p65 were significantly higher in model group and curcumin groups than that in control group (P<0.05), and the indexes above in curcumin groups were significantly lower than that in the model group, and the indexes in high dosage of curcumin group were lower than that in low dosage group (P<0.05). Conclusion Curcumin can effectively relieve the damage caused by cerebral ischemia and reperfusion in rats, and the pharmacodynamics mechanism may be related with its inhibition of the expression of TNF-α and NF-κB, MMP-2 and MMP-9.

curcumin; cerebral ischemia/reperfusion injury; blood-brain barrier

李冠，男，主管药师，主要从事药理学研究工作。

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.08.006

R-332

A

1008-8849(2015)08-0814-04

2014-10-16