FPR基因shRNA干扰载体的合成与构建

杨华等

摘要：目的 设计并构建靶向甲酰肽受体FPR基因的shRNA 慢病毒表达载体并鉴定。方法 根据GenBank数据库提供的FPR基因序列，设计合成针对FPR的shRNA序列，构建PDS019_pL/shRNA/GFP/F-FPR慢病毒载体，并通过测序鉴定。结果 成功构建的重组质粒测序结果与Genebank 中的FPR cDNA 序列相符。结论 构建FPR基因shRNA干扰载体，为该基因的相关实验研究提供载体。

关键词：FPR基因；载体构建

Abstract：Objective To construct and identify FPR shRNA lentiviral vector. Methods Genome sequences of FPR gene was retrieved from Genebank. The shRNA sequences for FPR were synthesized and cloned into PDS019_pL/shRNA/GFP/F to generate shRNA lentiviral vector. The recombinant vectors was identified by sequencing.Results The sequence identified by sequencing were the same as the targeting one. Conclusion The constructed FPR shRNA lentiviral vectors were constructed， which may be used for the further research the role of FPR in the malignant behavior of the cancer.

Key words：FPR； Vector construction

甲酰肽受体（Formyl peptide receptor， FPR）在肿瘤的发生、演进和转移过程中可能起重要作用。设计并构建针对FPR基因的RNA 干扰靶点慢病毒载体，为后续研究FPR在恶性肿瘤生物学行为中的影响提供基础。

1资料与方法

1.1一般资料 PDS019_pL/shRNA/GFP表达载体购自诺百生物科技（上海）有限公司。BsmbⅠ内切酶、EcoRI内切酶、T4DNA ligase 及GeneRuler DNA Ladder购自Fermentas公司；质粒抽提试剂盒及凝胶回收试剂盒购自Ayxgen公司；大肠杆菌STBL3 菌种购于TaKaRa公司；引物Oligo由Invitrogen公司合成；10×Oligo Annealing Buffer购自Invitrogen公司。

1.2方法

1.2.1利用在线软件设计并合成针对人类FPR的基因序列的干扰靶序列。

1.2.2干扰序列退火成双链DNA。在PCR扩增仪上进行退火反应，退火条件：95℃，5 min；72℃，5 min；自然降温至PCR的Block温度（25℃）。

1.2.3 PDS019_Pl/shRNA/GFP干扰慢病毒骨架载体经BsmbⅠ、EcoRI双酶切后，按照Axygen胶回收试剂盒说明进行胶回收。纯化后的酶切载体进行OD质检并定量。

1.2.4 PCR酶切产物与线性化的干扰骨架载体过夜连接。

1.2.5将连接产物转化感受态细菌， 涂板过夜培养后，随机挑选单菌落，用菌检PCR方法检测，然后挑取阳性克隆测序验证。

2结果

将阳性表达载体进行DNA序列测定，测序结果与实验设计的合成的FPR靶基因序列完全一致。结果表明，合成的寡核苷酸片段成功插入到慢病毒载体PDS019_Pl/shRNA/GFP中，PDS019_Pl/shRNA/GFP-FPR表达载体构建成功，见图1。

3讨论

甲酰肽受体属于G-蛋白偶联受体家族，由FPR1，FPR2 （FPRL1）和FPR3 （FPRL2）3个成员组成。FPR与激动剂结合后，能够触发胞内信号级联参与调节血管生成，细胞增殖，防止凋亡等[1-2]。在神经胶质瘤中，FPRs可能通过自分泌或旁分泌方式与局部刺激相互作用，在促进血管生成和肿瘤生长方面起到非常重要的作用[3-4]。而且， FPR1可以反式激活EGFR，二者共同作用促进神经胶质母细胞瘤的恶性表型[4-5]。FPR在恶性肿瘤发生、发展和转移中的作用越来越备受关注，有望成为肿瘤治疗的新靶点之一。

为进一步研究FPR在肿瘤发生发展及转移中的作用，本实验以FPR基因为靶基因，应用RNAi技术，设计3种针对FPR基因的特异性shRNA序列，构建3对慢病毒干扰载体，经PCR鉴定阳性克隆及DNA测序证实合成的寡核苷酸片段成功插入PDS019_Pl/shRNA/GFP，且插入片段与设计的靶序列一致，因此确定本实验成功构建了3种针对FPR基因RNA干扰靶点慢病毒载体。因此，后续实验将利用本实验成功构建的重组质粒以建立稳定干扰FPR表达的肿瘤细胞株，为进一步研究FPR在肿瘤发生发展的作用及可能的作用机制奠定实验基础。

参考文献：

[1]Cattaneo F，Guerra G，Ammendola R.Expression and signaling of formyl-peptide receptors in the brain [J].Neurochem Res，2010，35（12）：2018-2026.

[2]Li Y，Cai L，Wang H，et al.Pleiotropic regulation of macrophage polarization and tumorigenesis by formyl peptide receptor-2 [J].Oncogene，2011，30（36）：3887-3899.编辑/张燕