草鱼纤维素酶活性的研究

徐慧萍宋丽姿(山东省莱西市渔业技术推广站　山东　莱西　266600)

草鱼纤维素酶活性的研究

徐慧萍宋丽姿
(山东省莱西市渔业技术推广站山东莱西266600)

1　引言

草鱼是我国主要的淡水养殖鱼类之一，近年来随着我国水产饲料工业的发展及需求，人们对草鱼的营养需求量及饲料配方进行了不少研究，但在消化生理方面尤其是对纤维素酶的研究还是十分薄弱的。纤维素酶作为消化酶的一种，它具有独特的功能，可催化难于利用的纤维素转化成为易被机体消化、吸收利用的小分子物质。对于草鱼体内是否能分泌纤维素酶的问题,一直存在争议。因此，研究草鱼纤维素酶有助于了解草鱼对饲料中纤维素的消化利用情况，以便合理利用低值植物饲料资源，实现饲料配方的进一步优化和饲料成本的下降。同时还可为其他鱼类营养生理的研究提供参考。为此，本文研究了草鱼不同器官纤维素酶的分布，温度、pH值对纤维素酶活力的影响，以及用灌喂土霉素法探讨纤维素酶在肠道内是内源性，还是微生物产生。

2材料与方法

2.1试验材料

草鱼购于莱西水沟头市场，共26尾，体长30-45cm，体重0.996-2.107kg。土霉素通用名为盐酸土霉素，规格含量为1g(100万IU),由四川齐全动物药业有限公司生产。

2.2试验设计

2.2.1纤维素酶在草鱼体内的分布研究实验设计

目的是探讨草鱼体内有无纤维素酶,以及在不同器官(前肠、中肠、后肠、脾脏、肝胰脏、胆汁)中纤维素酶的分布情况。本实验取4尾鱼，将前肠、中肠、后肠、脾脏、肝胰脏、胆汁取出，称重，制取酶液。每个样品3次重复。采用羧甲基纤维素钠法测定纤维素酶活力大小。

2.2.2纤维素酶的适宜反应条件研究实验设计

购买鱼16尾，暂养于水族箱2h后取其内脏，分别称重并记录，制取酶液。每个样品3次重复。纤维素酶活力测定方法同上。

2.2.3纤维素酶来源初步研究实验设计

土霉素属四环族抗菌素，是一种广谱抗菌药，可抑制肠道中的微生物。因此，以灌喂蒸馏水作为对照组，通过灌喂土霉素测定肠道中纤维素酶活力的变化情况，对纤维素酶来源进行初步探讨。共取6尾鱼灌喂，分别灌喂土霉素和蒸馏水，3h后取样,灌喂量为1000ppm，1ml/50g鱼体重土霉素，蒸馏水剂量同土霉素。

2.3酶液的制备

健康的草鱼成鱼从市场上买回，实验前暂养于水族箱中2h后取样。在冰盘中解剖活鱼，取出内脏，置于碎冰中（保持在0-4℃状态下）.从肝胰脏、脾脏组织中随机取出一部分组织块，在电子天平（0.1mg）上称重；取出胆囊，将胆囊表面的脂肪及其他组织剔除干净，用蒸馏水冲洗胆囊外壁，再用脱脂棉球拭干，刺破囊壁，取出胆汁，称重；除去肠道内容物，用重蒸水洗净肠内壁，再用滤纸小心将多余水分吸干，分别称重。将所取样品分别加5倍重量的预冷重蒸水，在0~4℃玻璃匀浆器匀浆（胆汁除外）后，3500r/min离心20min，取上清夜作为粗酶提取液，置-40℃冰箱中冷冻保存，备用。

2.4纤维素酶活性测定方法和原理：

纤维素酶活性测定采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定。测定原理是羧甲基纤维素钠（CMC-Na）经纤维素酶作用后，生成还原糖，可与3,5-二硝基水杨酸(DNS)生成红色络合物，用比色法测定还原糖的多少，即可确定纤维素酶的活力。酶活单位的表示方法是：活性大小以每mg组织24℃每分钟催化纤维素生成葡萄糖(μg)表示（μg/min）。

2.5标准曲线的绘制

精确称取分析纯的无水葡萄糖250.0000mg，溶于蒸馏水中，定容至250毫升，吸取此液1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml、3.5ml、4.0ml、4.5ml、5.0ml，分别定溶至50ml，再分别吸取上述溶液各2.5ml于试管中，各加3ml 3,5-二硝基水杨酸，煮沸15min，（另作一管对照，取2.5ml蒸馏水，3ml 3,5-二硝基水杨酸，同样煮沸5min）。冷却后，用72型分光光度计，在530nm波长下比色，记录各管的光密度读数，以光密度作横坐标，绘制标准曲线，（糖液分别含糖0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg）。

2.6纤维素酶活性的测定

活酶活性测定：加pH=5的柠檬酸缓冲液3ml，CMC溶液2ml，酶液2ml（1ml），置于24℃水浴锅中糖化30min，取出后立即于沸水浴中煮沸15min，冷却后3000r/min离心10min，取1ml糖化液的上清夜加入3,5-二硝基水杨酸显色液3ml，于沸水浴中煮沸显色15min，冷却后加重蒸水6ml （3ml），530nm处测葡萄糖含量。

死酶活性测定：取2ml（1ml）酶液置于沸水浴中加热10min，冷却后加入pH=5的柠檬酸缓冲液3ml，CMC溶液2ml，酶液2ml（1ml），置于40℃水浴锅中糖化30min，取出后立即冷却后3000r/min离心10min，取1ml糖化液的上清夜加入3，5-二硝基水杨酸显色液3ml，于沸水浴中煮沸显色15min，冷却后加重蒸水6ml（3ml），530nm处测葡萄糖含量。

吸取1ml蒸馏水，加入3，5-二硝基水杨酸显色液3ml，于沸水浴中煮沸15min，冷却后加重蒸水6ml（3ml）作为空白对照组，与试验管一起保温比色。

读出光密度，在标准曲线上查出还原糖量，并计算出酶活力。

2.7纤维素酶活性的计算公式

Cx酶活力＝B×A×1000/30min＝（还原糖）μg/min

B—从标准曲线上查得的葡萄糖毫克数

A—酶液稀释倍数

2.8统计方法

采用SPSS12.0 for Windows软件对数据进行统计分析。

3　结果

3.1纤维素酶在草鱼不同器官的活性分布

纤维素酶活性分布顺序是肝胰脏>脾脏>肠道>胆汁。在肝胰脏内的活性及其显著，远远高于其他部位。胆汁的活性不明显。其在肠道的顺序后肠>前肠>中肠，但差异不显著（见表1）。

表1草鱼不同器官纤维素酶的活性　　单位:μg/min

3.2温度对纤维素酶的影响

本实验测定了20℃到52℃水浴，以4℃为温度梯度，对纤维素酶进行了研究（见图1-5）。从图中可以看出，在这五种器官中随着温度的升高，纤维素酶的活性总体呈下降趋势。在前肠20℃和28℃出现峰值。中肠和后肠均在20℃出现峰值。肝胰脏和脾脏均在24℃时出现峰值。表明20℃-24℃适合纤维素酶活性的发挥。在后面的实验中可以选择20℃-24℃作为纤维素酶活性测定的温度条件。

3.3 pH值对纤维素酶活性的影响

在pH值3.6-7.2，纤维素酶在前肠、中肠、后肠中均有两个峰值。前肠为6.0和7.2，后肠为6.4 和7.2，而在中肠为5.2和6.0（见图6）。这与肠道的pH值偏于酸性弱碱性是大体相似的。在脾脏其活性最大为6.0，而在5.2时其活性仅次于6.0（见图7）。pH值为4.8和6.4时，纤维素酶在肝胰脏的活性最大（见图8）。由此可以认为在酸性环境条件下有利于纤维素酶活性的发挥。

3.4灌喂土霉素法,初步探讨草鱼肠道纤维素酶的来源

本实验采用灌喂蒸馏水作为对照组，以50g鱼体重灌蒸馏水1ml为标准；土霉素浓度为1000ppm，1ml/50g鱼体重，灌喂量同对照组。灌喂后3h取样。后肠纤维素酶活性明显下降，前肠和中肠的变化不明显（见图9）。

4分析与讨论

目前,对鱼类消化系统中是否存在纤维素酶尚有争议。Migita等(1949)曾发现鲫鱼(Carassius auratus)消化系统中有纤维素酶活动。吴婷婷等(1994)在鲢,鳙,草鱼等鱼类均已发现存在纤维素酶活性。沈文英等(2002，2003)对银鲫纤维素酶进行了有关研究。林浩然认为在一些过河口性鱼类的肠道中存在分泌纤维素酶的肠道细菌。最近,对虾蟹等水产动物中存在纤维素酶进行的大量研究。而Fish（1951）和Barrington（1957）曾认为鱼类没有纤维素酶。

本实验，在草鱼肠道，脾脏，肝胰脏中发现纤维素酶。在肝胰脏中活性很大，脾脏次之，肠道中也有明显活性。从实验结果来看，对于草食性鱼类饲料中应当添加适量的纤维素。

温度、pH值对于鱼类生理活动的影响是多方面的。沈文英等（2003）研究了鱼类消化酶与温度的关系，认为温度升高，鱼类消化酶活性增强,但此种正相关不是无限的。本实验结果表明在温度20℃-28℃之间时，肠道、脾脏和肝胰脏的纤维素酶活性较强。这一结果与草鱼的最适生长温度大致相吻合。而酸碱度的作用一方面是对食物进行酸碱性消化，另一方面是为消化酶提供适宜的酸碱度利于纤维素酶活性的发挥。因此，在人工配合饲料生产中应充分考虑饲料的成分及对其消化利用。本实验结果肠道在偏酸性、弱碱性时的纤维素酶活性最大，而脾脏、肝胰脏在酸性条件下有利于纤维素酶，以提高饲料成分的消化吸收。

从实验结果来看，草鱼肠道内的纤维素酶既有肠道自身分泌又有其内部微生物产生。前肠和中肠微生物产生不明显，而后肠灌喂土霉素组与对照组有明显的差异，说明在草鱼的后肠内可能存在分泌纤维素酶的微生物或是能够刺激纤维素酶产生的细菌，这还有待进一步研究。

参考文献（略）