重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子凝胶对深II度烧伤创面愈合的影响及其机理分析

刘继松，赵经纬，章祥洲，杜 娟，方 勇

重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子凝胶对深II度烧伤创面愈合的影响及其机理分析

刘继松1，赵经纬1，章祥洲1，杜 娟1，方 勇2

目的 验证重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)对深II度烧伤溶痂和愈合的效果并分析其可能的机理。方法 70只SD大鼠制成背部深II度烧伤创面后随机分为实验组和对照组，分别于制创后1、3、5、7、10、14和21d观察2组动物创面情况并摄像，记录创面愈合时间；用图像分析软件计算不同时相点的溶痂率；ELISA法测定创面弹力蛋白酶(NE)和基质金属蛋白酶(MMP-1、MMP-9)的蛋白表达。结果 实验组创面溶痂时间为(10.73±2.47)d，较对照组(14.26±2.65)d显著缩短(P<0.01)；实验组和对照组创面愈合时间分别为(16.21±1.27)d和(18.05±1.36)d，差异有非常显著性(P<0.01)；2组动物创面伤后3～7 d,NE、MMP-1和MMP-9水平实验组明显高于对照组(P<0.01)。结论 外源性rhGM-CSF的应用可提高创面局部NE、MMP-1、MMP-9的蛋白表达，促进创面溶痂，从而促进深II度烧伤创面愈合。

烧伤； 深II度； 创面愈合； 溶痂； 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子

深II度烧伤创面坏死组织是影响创面愈合的重要因素，由于其坏死组织的持续存在，导致局部组织进行性损害和创面感染的发生[1]，及早清除坏死组织是加快创面愈合的重要手段。粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor ，GM-CSF)是来源于创面修复细胞的四螺旋束原型结构的细胞因子，近年来的研究表明，GM-CSF是一种多功能生长因子与创面愈合密切相关，动物实验研究证实[2-3]，GM-CSF通过激活创面局部炎症细胞促进创面愈合。由于炎症细胞激活和其所分泌的蛋白酶的作用是深II度烧伤创面溶痂的重要因素，故我们设想GM-CSF可能具有通过激活创面局部炎症细胞，促进创面蛋白酶类分泌，发挥深II度烧伤创面溶痂的作用，并以此促进创面愈合。本研究将通过动物实验来验证重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)是否促进创面释放的酶物质(如弹力蛋白酶、基质金属蛋白酶)等促进创面坏死组织脱落而起到加速创面愈合作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料 实验动物及试剂：实验动物：雄性SD大鼠70只，8～10周龄，体重230～260 g，购自中国医学科学院上海实验动物中心。动物生产许可证号码为SCXK(沪)2007-2005，使用许可证号码为2003-0026。动物自由饮食，饲养于标准动物房内。适应性喂养2周后进行试验。试剂使用：外用重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子凝胶(rhGM-CSF100μg/10g)，凝胶基质(不含rhGM-CSF)由长春金赛药业有限公司提供。

1.2 实验方法

1.2.1 烧伤动物模型制作 烧伤创面模型制作及干预措施：实验大鼠用3%戊巴比妥钠(50 mg/Kg)腹腔注射麻醉。麻醉起效后，背部用理发器剃毛，硫化钡脱毛后用电热恒温水浴箱在大鼠背部，制成3 cm×3 cm的圆形深Ⅱ度烧伤创面(致伤温度为75℃，致伤时间8 s)。次日经病理证实为深II度烧伤创面。

1.2.2 分组处理 创面模型制作完成后，70 SD烧伤大鼠根据创面不同的处理方式分为2组：rhGM-CSF处理组(n=35)：创面给予外用100 μg/10g rhGM-CSF凝胶；对照组(n=35)：创面给予外用不含任何药物的凝胶。所有创面均清洁包扎防污染，分笼饲养，每日换药至伤后21 d或创面完全愈合为止。

1.3 观察和检测项目 分别于创面形成的第1、3、5、7、10、14、21天各组随机取动物5只，用透明方格纸测得创面痂皮面积后处死，切取创面组织用于基质金属蛋白酶的测定。

1.3.1 创面溶痂率的测定 采用透明方格纸，沿创面痂皮边缘描记创面大小形状，以用药前痂皮面积为初始面积，分别记录各组创面形成后第1、3、5、7、10、14天痂皮面积。Osiris 软件进行创面痂皮面积计算。公式如下：创面溶痂率=(创面初始痂皮面积-创面形成后第n天的创面痂皮面积)/创面初始痂皮面积×100%。

1.3.2 创面愈合时间 记录2组大鼠烧伤创面的愈合时间，并做统计学分析。

1.3.3 创面活性酶的检测 取待测的皮肤组织制备组织匀浆，采用酶联免疫吸收测定法(ELISA)定量测定皮肤组织中金属蛋白酶(NE、MMP-1、MMP-9)的含量。检测严格按照R&D试剂盒操作说明进行。

2 结果

2.1 2组大鼠创面溶痂率比较 实验组大鼠在创面形成后第5、7、10天溶痂率均明显高于对照组(P<0.01)；而2组大鼠创面形成后第14天创面溶痂率无统计学意义。见表1。

表1 2组烧伤大鼠不同时间创面溶痂率(%)比较 ±s)

2.2 创面愈合时间 实验组和对照组创面愈合时间分别为(16.21±1.27)d和(18.05±1.36)d，差异有非常显著性(P<0.01)。

2.3 创面组织NE、MMP-1、MMP-9含量测定

2.3.1 中性粒细胞弹性蛋白酶 2组大鼠烧伤创面各时相点NE含量比较，大鼠皮肤组织中NE含量大体呈现第5天增高至峰值后渐降趋势。伤前2组创面NE相比，无统计学差异(P>0.05)。烧伤后各时相点实验组大鼠皮肤组织中NE含量均高于对照组，并于第3、5、7天最为显著(P<0.01)。见表2。

表2 2组大鼠烧伤创面各时相点NE含量比较

2.3．2 基质金属蛋白酶MMP-1的测定 2组大鼠烧伤创面各时相点MMP-1含量比较：大鼠皮肤组织中MMP-1含量大体呈现第3天增高至峰值后渐降趋势。伤前，2组创面MMP-1相比，无统计学差异(P>0.05)。烧伤后各时相点实验组大鼠皮肤组织中MMP-1含量均高于对照组，并于第3、5天明显高于对照组(P<0.01)，MMP-1含量于烧伤后第3天差异最为显著，实验组创面MMP-1含量为(1165.51±104.58)μg/L，对照组为(796.52±76.27)μg/L。见表3。

表3 2组大鼠烧伤创面各时相点MMP-1含量比较

2.3．3 基质金属蛋白酶MMP-9的测定 2组大鼠烧伤创面各时相点MMP-9含量比较：大鼠皮肤组织中MMP-9含量大体呈现第3天增高至峰值后渐降趋势。伤前两组创面MMP-9相比，无统计学差异(P>0.05)。烧伤后各时相点实验组大鼠皮肤组织中MMP-9含量均高于对照组，并于第3、5天显著高于对照组(P<0.01)，MMP-9含量于烧伤后第3天差异最为显著，实验组创面MMP-9含量为(1258.51±123.18)μg/L，对照组为(839.42±69.12)μg/L。见表4。

表4 2组大鼠烧伤创面各时相点MMP-9含量比较

3 讨论

深II度烧伤创面有其特殊的病理生理特点，其预后也不同于一般的机械性损伤。其根本原因在于烧伤创面本身的坏死组织。创面的坏死组织不仅会影响创面边缘或残留附件中的表皮细胞分裂增殖后向无表皮区爬行修复创面而且会引起局部的炎症反应导致创面感染，加重创面的损害，使创面愈合延迟；因此及早去除创面坏死组织是深度烧伤治疗的关键。目前去除深II度烧伤创面坏死组织的方法有手术削痂和药物溶痂[4-6]，前者需掌握比较好的手术技巧，否则容易损伤正常组织，易使创面加深；后者则因为效果不佳，并易致创面感染，不宜被临床接受[7-8]。因此有必要寻找一种方法，既能促使深度烧伤创面溶痂，又能启动皮肤干细胞再生，达到加快创面修复的目的。目前研究认为[9]，对创面溶痂起促进作用的因素包括：(1)早期创面中性粒细胞、巨噬细胞的数量和功能；(2)各种活性酶类在创面中的释放等。创面中的中性粒细胞巨噬细胞浸润活化有利于其增加吞噬及分泌蛋白酶的功能，利于自身清除创面坏死组织，NE是中性粒细胞(poly-morphonuclear neutrophilic，PMNs)分泌的重要蛋白酶，属于丝氨酸蛋白酶的糜蛋白酶超家族成员，它能够分解几乎所有细胞外基质和许多重要的血浆蛋白，被认为是最具破坏力的酶类之一。NE同时具有防御组织损伤、促分泌、放大炎症等作用，NE的增高提示了中性粒细胞的活性和促进对坏死组织的溶解。加速局部坏死组织的脱落及对入侵细菌的防御力，促进机体的自溶性清创，提高局部免疫力以抗感染[10]，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)为一特异的酶家族，其成员均为锌依赖性肽链内切酶，主要功能为降解细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)。经MMPs达到ECM 的可控性降解。

既往研究表明[11-12]，粒细胞单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)与创面愈合关系密切，GM-CSF基因缺失小鼠的创面愈合显著延迟，而局部使用GM-CSF可以促进糖尿病小鼠切割伤创面愈合。GM-CSF促进创面愈合的机理可能是通过激活创面局部的炎症细胞，通过细胞因子促进创面的血管化从而达到促进创面愈合的作用。研究表明GM-CSF是一种多动能生长因子，是否GM-CSF通多促进创面炎症细胞浸润及及其通过炎症细胞所释放的酶物质(如弹力蛋白酶、基质金属蛋白酶)等促进创面坏死组织脱落而起到加速创面愈合作用，故我们通过动物实验验证GM-CSF是否具有促进深II度烧伤创面溶痂的作用而促进创面愈合。

本研究发现，深II度烧伤创面使用GM-CSF后，无论固定时相点创面溶痂率还是创面溶痂时间及创面愈合时间都较对照组显著改善，固定时相点溶痂率显著高于对照组，且创面愈合时间提前。实验结果提示GM-CSF具有促进中性粒细胞弹性蛋白酶，基质金属蛋白酶的表达作用，以促进烧伤创面坏死组织的分解和脱落,从而促进创面愈合。

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Effects of recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor on debridement of deep partial-thickness burn

LIUJi-song,ZHAOJing-wei,ZHANGXiang-zhou,etal.

(BengbuThirdPeople'sHospital，Anhui233000，China)

Objective To determine the effect of recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor(rhGM-CSF) on debridement of eschar in deep partial thickness scalding wound and the mechanism for debridement of rhGM-CSF.Methods A total of 70 SD rats were scalded on the back.A deep partial-thickness burn was created in all the rats.The scalded rats were randomly divided into a control group(C) and an experimental group (E).Observations of the wounds were conducted by photograph at various time-points.In addition,the removal time of wound eschar in all animals was recorded.The percentages of removal area in the wounds were calculated by image analysis software in various time-points.ELISA was used to detect the expression of NE,MMP-1,and MMP-9.Results The average removal-time of eschar in the experimental group was 10.73 ± 2.47d，which was much shorter than that in the control group's 14.26 ± 2.65d(P<0.01).The time of wound healing in the experimental group was 16.21 ± 1.27d，which was significantly shorter than that in the control group's 18.05 ± 1.36d(P<0.01).The levels of NE,MMP-1 and MMP-9 in the experimental group were significantly higher than that in the control group from day 3 to 7 after injury(P<0.01).Conclusion RhGM-CSF gel may promote debridement and wound healing in deep partial thickness burn,the mechanism of which may be associated with upregulation of expression of the enzyme activity.

Burn; Deep partial-thickness burn; Wound healing; Debridement; Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor

10.14126/j.cnki.1008-7044.2015.03.004

1.安徽省蚌埠市第三人民医院 烧伤整形科，233000；2.上海交通大学第三附属人民医院 烧伤整形科，上海 201999

刘继松(1980-)，男，安徽蚌埠市人，主治医师，研究生。

R644

A

1008-7044(2015)03-0219-03

2014-10-03)