59例慢性淋巴细胞白血病分子遗传学异常的FISH检测*

傅 蔷，林晓岚，陈万紫，陈加弟，黄慧芳

(福建医科大学附属协和医院福建省血液病研究所/



·论 著·

59例慢性淋巴细胞白血病分子遗传学异常的FISH检测*

傅 蔷，林晓岚，陈万紫，陈加弟，黄慧芳△

(福建医科大学附属协和医院福建省血液病研究所/

福建省血液病学重点实验室，福州 350001)

目的 探讨间期荧光原位杂交(FISH)技术检测慢性淋巴细胞白血病(CLL)常见分子遗传学异常的意义。方法 采用CSF12(12p11.1～12q11.1)、D13S25(13q14.3)、RB1(13q14)、ATM(11q22.3)及p53(17p13.1)等5种探针对59例初诊CLL患者的骨髓细胞进行间期FISH检测，分析上述分子遗传学异常与患者的临床Binet分期、Ria分期及相关实验室检查，包括初诊时外周血淋巴细胞绝对值计数、血红蛋白(Hb)水平、血小板计数(PLT)，血清乳酸脱氢酶(LDH)、β2-微球蛋白(β2-MG)、CD38和ZAP70水平的相关性。结果 59例CLL初诊患者中，存在1种及1种以上分子遗传学异常的有49例，占83.1%。其中，del(13q) 34例(69.4%)，12号染色体三体(+12)和p53基因缺失各11例(22.4%)，ATM基因缺失5例(10.2%)。各分子遗传学异常与患者临床分期、外周血淋巴细胞计数绝对值、Hb、PLT、LDH、β2-MG、CD38和ZAP70表达水平之间均无明显相关性(P>0.05)。≥60岁患者del(13q)异常率(67.6%)显著高于<60岁患者(40.9%)，女性患者p53基因缺失的异常率(35.2%)显著高于男性患者(11.9%)，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 FISH技术是检测CLL患者分子遗传学异常快速、准确、敏感的方法，分子遗传学异常与患者初诊时临床表现之间无明显相关性。

慢性淋巴细胞白血病； 荧光原位杂交； 分子遗传学

慢性淋巴细胞白血病(CLL)是一种低度恶性的B淋巴细胞克隆性增殖疾病，预后个体差异很大，染色体异常是影响CLL预后和进展的重要因素，同时也是指导临床治疗的重要参考。但是由于CLL细胞有丝分裂指数低下，仅有20%左右的CLL患者能够通过常规染色体显带技术(CC)检测到克隆性染色体异常。间期荧光原位杂交(FISH)技术不受分裂象的限制，能够通过特定探针特异性地检测间期细胞的遗传学异常，大大提高了其细胞遗传学的异常检出率。本研究应用FISH技术，采用5种探针检测59例初诊CLL患者常见的遗传学异常，并结合患者初诊时的临床资料，探讨各种遗传学异常在临床诊断和预后判断中的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2013年1月至2014年12月福建医科大学附属协和医院血液科收治的初诊CLL患者59例，其中男42例，女17例，年龄33～85岁，中位年龄62岁，所有病例诊断标准参照《中国慢性淋巴细胞白血病诊断与治疗专家共识》[1]。

1.2 仪器与试剂 固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)，2×枸橼酸盐(SSC)缓冲液，100%乙醇，85%乙醇，70%乙醇，北京金菩嘉公司的CSF12(12p11.1～12q11.1)、D13S25(13q14.3)、RB1(13q14)、ATM(11q22.3)及p53(17p13.1)5种探针(浓度为0.1%)，NP-40/2×SSC缓冲液，烤片机，水浴箱，Thermobrite杂交仪，OlympusBX51荧光显微镜。

1.4 统计学处理 采用SPSS18.0软件包进行统计学处理，率的比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1FISH检测结果 59例CLL初诊患者中，存在1种及1种以上分子遗传学异常的有49例，占83.1%。检出del(13q)34例，占69.4%(34/49)。del(13q)有3种模式，其中单纯RB1基因(13q14)缺失1例，占2.9%(1/34)；单纯D13S25(13q14.3)缺失11例，占32.4%(11/34)；以上二者共同缺失22例，占64.7%(22/34)。12号染色体三体(+12)和p53基因缺失均为11例，各占22.4%(11/49)。ATM基因缺失5例，占10.2%(5/49)。11例检出2种及2种以上异常，占18.6%；均存在del(13q)。其中，del(13q)伴+12和del(13q)伴p53基因缺失者均有4例，各占36.4%(4/11)；del(13q)伴ATM基因缺失仅有1例，占9.1%(1/11)；有2例同时存在del(13q)、ATM缺失和P53缺失。

2.2 分子遗传学异常与相关预后因素之间的关系 59例病例，根据Rai分期，0期16例，Ⅰ期18例，Ⅱ期13例，Ⅲ期4例，Ⅳ期8例；根据Binet分期，A期28例，B期19例，C期12例。患者性别、年龄、临床分期、外周血淋巴细胞绝对值计数、Hb、PLT、LDH、β2-MG、CD38和ZAP70表达的不同分组中检出的分子遗传学异常率，见表1。各遗传学异常与患者临床分期、外周血淋巴细胞计数绝对值、Hb、PLT、LDH、β2-MG、CD38和ZAP70表达水平之间差异无统计学意义(P>0.05)；60岁以上患者del(13q)异常率(67.6%)显著高于60岁以下患者(40.9%)，差异有统计学意义(P=0.03)；女性患者p53基因缺失的异常率(35.2%)显著高于男性患者(11.9%)，差异有统计学意义(P=0.04)。

表1 不同临床资料患者分子遗传学的异常检出率[n(%)]

续表1 不同临床资料患者分子遗传学的异常检出率[n(%)]

注：与男性比较，*P<0.05；与≥60岁患者比较，#P<0.05。

3 讨 论

CLL是西方国家成人最常见的一种白血病，但在我国发病率较低，它是一种低度恶性的小淋巴细胞克隆性疾病，多见于老年人。CLL患者的预后差异显著，染色体异常是影响CLL预后和进展的一个重要因素；但是由于CLL细胞大多处于间期，增殖能力低下，北京大学血液病研究所的1项多中心研究表明，常规染色体显带技术仅有19.6%能够检测到克隆性染色体异常，且最常见的染色体异常为+12[2]。FISH技术利用碱基互补配对原则，用核酸探针来检测染色体上相应碱基片段的改变，可以同时分析中期和间期细胞的染色体异常，且FISH技术具有更高的灵敏度，能够检测出常规核型分析所不能发现的DNA小片段(1～103kb)改变；因此，FISH检测大大提高了CLL患者遗传学异常的检出率。

本研究中的59例患者中位年龄为62岁，男性患病率为女性的2.5倍，FISH检测出的遗传学异常率为83.1%，高于国内报道的63.3%～72.7%[3-4]， 与Döhner等[5]的报道相近。最常见的分子遗传学异常为del(13q)，占所有异常的69.4%；其次为+12和p53基因缺失，各占22.4%；ATM缺失仅有5例，占10.2%。与Lai等[2]报道的del(13q)(56.4%)，+12(34.5%)，p53基因缺失(33.5%)和ATM缺失(30.5%)相比，除了del(13q14)检出率较高以外，其余检出率均较低，但高于Durak等[6]报道的del(11q22)5.1%的检出率。

有研究表明，单纯del(13q)的患者预后较好，其总体生存率甚至高于核型正常患者，但同时伴有+12、ATM缺失或P53缺失的患者预后较差[7]。Döhner等[5]的研究指出del(13q)的中位生存期(MS)为133个月，无治疗生存期(TFS)可达92个月。但李文君等[8]发现RB1缺失阳性的患者Binet分期级别较高。本研究中23例RB1阳性患者Binet分期处于A期的有11例，B～C期的有12例，并无显著差异。同时，本研究发现60岁以上患者del(13q)检出率显著高于60岁以下患者(P=0.03)。

+12是首先被发现的CLL常发的染色体异常，发生率为10%～35%[2]。有文献报道，+12的患者常见于晚期，具有中等的预后及生存率[9]。但也有学者在用FISH评估+12对预后的影响时发现，患者是否存在+12与其生存期的长短并无相关性[5，10]。丛佳等[11]的研究发现+12遗传学异常在>60岁年龄组中更易出现。本研究中11例检出+12的患者中有7例为>60岁，但并未发现+12与年龄之间具有显著相关性。

ATM基因位于11q22常见的缺失区，可能在细胞周期调控的DNA损伤修复中发挥作用，并与激活肿瘤抑制基因p53有关，伴有ATM基因缺失的CLL患者发病年龄一般在55岁以下，且病程常表现为侵袭性，有广泛的外周、腹部、纵隔淋巴结肿大，疾病进展迅速，预后差[11]。本研究中，<60岁的患者ATM缺失率为13.6%，≥60岁的患者为5.4%，提示ATM缺失的年轻患者较多。李文君等[8]发现ATM缺失与患者血红蛋白水平有显著相关性，ATM缺失的患者更易出现全身广泛淋巴结肿大，而全身淋巴结肿大和低血红蛋白水平均导致预后不良。但本研究中的5例ATM缺失患者中，有4例处于Binet A期，且5例患者的Hb浓度均高于110 g/L，可能与样本量较少或区域差异有关。

p53基因定位于17p13，是人体重要的抑癌基因。p53基因缺失是预后不良的重要指标，患者多处于疾病晚期[2]。El-Ghammaz等[12]指出17p-阳性患者多为65岁以上，Rai分期Ⅱ以上，并具有更高水平的LDH和β2-MG。而买买提力·依马木等[13]的研究结果提示p53基因缺失与疾病后期及ZAP-70高表达有关。本研究发现女性患者p53基因缺失的异常率(35.2%)显著高于男性患者(11.9%)，差异有统计学意义(P=0.04)；p53基因缺失的患者中，≥60岁和Rai分期Ⅱ以上的患者，均占45.5%(5/11)；但仅有1例患者ZAP70高表达。各项临床指标与p53基因缺失的相关性有待于继续扩大样本量进行深入研究。

B细胞CD38或ZAP70表达与免疫球蛋白重链可变区(IgHV)突变情况有一定相关性，CD38或ZAP70阳性患者预后差[1]。因此，CD38或ZAP70常被作为有价值的CLL预后指标。本研究中检出7例CD38或ZAP70高表达患者，其中2例处于Binet A期，均为单纯del(13q)；5例处于Binet B～C期，其中2例p53基因缺失，1例+12，1例del(13q)伴+12。但未发现CD38或ZAP70表达与临床分期及各种遗传学异常间的相关性。研究中还发现1例RB1、D13S25、ATM、+12和p53均扩增的患者，Binet分期A期，其临床表现及预后还有待于进一步随访观察。

本研究发现各遗传学异常与患者临床分期、外周血淋巴细胞绝对值计数、Hb、PLT、LDH、β2-MG、CD38和ZAP70表达水平之间无明显相关性；≥60岁患者del(13q)检出率显著高于<60岁患者；女性患者p53基因缺失的检出率显著高于男性患者。将来，本实验室将通过扩大样本量及对患者预后做长期随访观察以深入探讨遗传学异常与CLL预后的相关性。

[1]李建勇,邱录贵.中国慢性淋巴细胞白血病诊断与治疗专家共识[J].中华血液学杂志,2010，31(2):141-144.

[2]Lai YY,Huang XJ.Cytogenetic characteristics of B cell chronic lymphocytic leukemia in 275 Chinese patients by fluorescence in situ hybridization:a multicenter study[J].Chin Med J(Engl),2011，124(16):2417-2422.

[3]戴丹,张秀群,张学忠，等.30例慢性淋巴细胞白血病分子遗传学异常的FISH检测的意义[J].中国实验血液学杂志,2009，17(1):31-35.

[4]Qiu HX,Xu W,Cao XS,et al.Cytogenetic characterisation in Chinese patients with chronic lymphocytic leukemia:a prospective,multicenter study on 143 cases analysed with interphase fluorescence in situ hybridization[J].Leuk Lymphoma,2008，49(10):1887-1892.

[5]Döhner H,Stilgenbauer S,Benner A,et al.Genomic aberrations and survival in chronic lymphocytic leukemia[J].N Engl J Med,2000，343(26):1910-1916.

[6]Durak B,Akay OM,Aslan V,et al.Prognostic impact of chromosome alterations detected by FISH in Turkish patients with B-cell chronic lymphocytic leukemia[J].Cancer Genet Cytoqenet,2009，188(2):65-69.

[7]Saqatys EM,Zhang L.Clinical and laboratory prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia[J].Cancer Control,2012,19(1):18-25.

[8]李文君,郭力,侯明,等.慢性淋巴细胞白血病间期荧光原位杂交检测染色体异常及临床分析[J].中国实验血液学杂志,2010,18(2):494-498.

[9]Zenz T,Döhner H,Stilqenbauer S.Genetics and risk-stratified approach to therapy in chronic lymphocytic leukemia[J].Best Pract Res Clin Haematol,2007,20(3):439-453.

[10]曹鹏飞,陈苏华,张国平,等.荧光原位杂交技术检测慢性淋巴细胞白血病细胞遗传学的异常[J].临床血液学杂志,2014,27(3):240-243.

[11]丛佳,李辉,周道斌,等.84例慢性淋巴细胞白血病遗传学异常及预后分析[J].基础医学与临床,2012,32(1):1-6.

[12]El-Ghammaz AM,Abdelwahed E,Mostafa NN,et al.De novo deletion 17p13.1 as a predictor for disease progression in chronic lymphocytic leukemia[J].Clin Exp Med,2014:317-318.

[13]买买提力·依马木,古再丽努尔·吾甫尔,王晓敏,等.荧光原位杂交技术检测新疆慢性淋巴细胞白血病患者p53基因缺失及其临床意义[J].中华医学遗传学杂志,2014,31(4):499-503.

Fluorescence in situ hybridization detection of molecular cytogenetic aberrations in 59 patients with chronic lymphocytic leukemia*

FUQiang，LINXiao-lan，CHENWan-zi，CHENJia-di，HUANGHui-fang△

(FujianInstituteofHematology/FujianProvincialKeyLaboratoryonHematology,FujianMedicalUniversityUnionHospital,Fuzhou,Fujian350001,China)

Objective To investigate the significance of interphase fluorescence in situ hybridization(FISH) technology for detecting common molecular cytogenetic abnormalities in the patients with chronic lymphocytic leukemia(CLL).Methods The bone marrow cells from 59 patients with newly diagnosed CLL were performed the interphase FISH detection by 5 probes,including CSF12(12p11.1-12q11.1),D13S25(13q14.3),RB1(13q14),ATM(11q22.3) and p53(17p13.1).Then the correlation between the molecular cytogenetic abnormalities and the clinical Binet staging,Rai staging and the related laboratory examinations including peripheral blood lymphocyte absolute count,Hb,PLT,LDH,β2-MG,ZAP70 and CD38 levels were analyzed.Results Among 59 cases of newly diagnosed CLL,49 cases(83.1%) had one and more than one kind of molecular cytogenetic aberrations,in which del(13q) was 34 cases(69.4%),each of +12 and del(p53) was 11 cases(22.4%) and del(ATM) was 5 cases(10.2%).The molecular cytogenetic abnormalities had no obvious correlation with the Binet staging,Rai staging,peripheral lymphocyte absolute count,Hb,PLT,serum levels of LDH,β2-MG,ZAP70 and CD38(P>0.05).The abnormality rate of del(13q) in the over 60 years old group was significantly higher than that in the less than 60 years old group(P=0.03),and the abnormality rate of p53 deletion in female was higher than that in male,the differences were statistically significant(P<0.05).ConclusionTheFISHtechnologyisarapid,accurateandsensitivemethodindetectingmolecularcytogeneticabnormalitiesinCLLpatients,andthereisnosignificantcorrelationbetweenmolecularcytogeneticabnormalitiesandclinicalmanifestationsinfirstvisitinghospital.

chroniclymphocyticleukemia；FISH；moleculargenetics

国家临床重点专科建设项目(财社[2011]170号)；福建省临床重点专科建设项目(闽卫科教[2012]149号)。

傅蔷，女，本科，检验技师，主要从事临床检验研究。△

，E-mail：huanghuif@126.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.20.009

A

1672-9455(2015)20-2991-03

2015-01-29

2015-04-17)