荧光原位杂交技术在先天性心脏病产前诊断中的应用

赵 婧,黄 湘,李红艳,梁少霞

(广东省中山市博爱医院产前诊断中心 528400)



·论 著·

荧光原位杂交技术在先天性心脏病产前诊断中的应用

赵 婧,黄 湘,李红艳,梁少霞

(广东省中山市博爱医院产前诊断中心 528400)

目的 探讨采用荧光原位杂交技术(FISH)检查法对先天性心脏病胎儿进行染色体22q11微缺失产前诊断的临床应用。方法 应用常规染色体核型分析及FISH检查法，对2012年3月至2014年10月中山市博爱医院收治的52例疑似妊娠22q11微缺失胎儿的孕妇进行产前22q11微缺失检查并跟踪随访。结果 所有胎儿染色体核型分析均无异常，FISH检查结果显示3例呈阳性。结论 染色体核型分析无法检测22q11微缺失综合征，因此对有22q11微缺失先天性心脏病风险的胎儿产前诊断应用FISH检查法，可提高检测的准确性。

22q11微缺失;荧光原位杂交技术;先天性心脏病;产前诊断

先天性心脏病(CHD)是一种严重影响人类健康的疾病，其病因复杂，治疗困难。我国每年大约有(10～15)万CHD患儿出生，患儿家庭和社会都承担着巨大的负担。CHD主要是指胎儿在胚胎发育期心脏及周围血管组织发育异常造成的胎儿出生后心脏、血管功能结构的异常，是最常见的一种胎儿畸形，也是我国生育监测的主要病种之一[1]。新生儿CHD患病率为0.8%～1.0%，因为CHD治疗困难、新生儿手术的复杂和危险，使CHD病死率极高。有统计显示，死胎死产中有1/5是患有严重CHD的胎儿，而因先天性缺陷夭折的新生儿中严重CHD患儿占1/3，儿童期死亡患儿超过半数是CHD患儿[2]。作为一种先天畸形疾病，CHD的发病原因复杂，目前研究主要与遗传、环境、遗传-环境因素共同作用有关[3]。遗传因素主要体现为染色体异常，而22q11微缺失综合征是最常见的一种染色体异常，是比较常见的CHD病因。研究报道最多的心脏畸形，国内比例为74%，美国该比例达85%，一般是圆锥动脉干呈现畸形，表现为法洛四联征、主动脉中断、肺动脉闭锁、室间隔缺损等，前二者疾病的预后极差[4]。对于22q11微缺失的检查，由于该缺失片段大小在1.5～3.0 Mb，是比进行染色体核型分析时的分辨下限5.0 Mb还小的片段，因此通过常规的染色体核型分析产前诊断法无法检测出该疾病，需要引入分辨率更高的技术手段。本研究采用荧光原位杂交技术(FISH)检查法对22q11微缺失CHD胎儿进行产前诊断，FISH检查法是将经荧光标记的特异性探针与相关染色体中DNA序列杂交，再通过荧光显微镜观察待检染色体是否存在某些片段的缺失[5]。该方法快速、准确、敏感性高、特异性强，是进行22q11微缺失检查的首选技术。本研究即对使用FISH检查法的22q11微缺失CHD胎儿的产前检查的临床应用进行探讨，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2012年3月至2014年10月本院收治的52例似妊娠22q11微缺失胎儿的孕期妇女作为研究对象，所有产妇的胎儿胎龄3～8个月不等，孕妇年龄23～35岁，平均28.4岁。研究对象包括24例曾生产或引产过一个CHD或面部畸形胎儿的孕妇，本次妊娠的彩色多普勒超声检测中未显示心脏畸形或面部畸形；23例产前彩色多普勒超声检测显示胎儿有心脏畸形[6]；5例超声检测怀疑胎儿有唇、腭裂。进一步研究前，所有病例及其家属均知晓研究内容，签署知情同意书，此研究获得了医院伦理委员会批准。

1.2 方法 进行羊水细胞的常规染色体核型分析及FISH检查[7]。

1.2.1 羊水细胞获得 施行羊膜腔穿刺术以获得适量羊水细胞，用于实验室的染色体核型分析及FISH检查。采集羊水细胞前，产妇排净膀胱、仰卧位；事前经超声检查确定胎盘位置、羊水深度，便于穿刺部位的选择；穿刺时一手固定穿刺部位，一手准确将穿刺针垂直刺入宫腔，拔除针芯，见有清亮的淡黄色羊水溢出，使用注射器抽取10 mL羊水后再插入针芯、拔除穿刺针。将羊水存入无菌试管，送实验室培养以进行下一步检查；对产妇穿刺部位进行无菌敷料处理，观察半小时如无异常，告知相关注意事项后即可离开。

1.2.2 常规染色体核型分析 22q11微缺失综合征除了微片段缺失外，可能还伴有染色体异位，数目、形态异常(环形)等畸变。因此在进行FISH检查前常需通过常规染色体核型分析以排除可能的畸变。将所采集的羊水装于离心管中进行细胞接种培养；获得的细胞经固定、滴片、烤片制成标本，将染色体标本片放入所制备的胰蛋白酶溶液中，振摇2、3 min用生理盐水漂洗，经染色剂染色、冲洗、晒干后进行镜检，查看染色体带纹显现(显带)效果，可多做几次取得最满意效果；选择镜检中分散效果较好的核型为图像采集对象。

1.2.3 FISH检查 将染色体核型分析余下的细胞悬液制成标本片备用。以北京金菩嘉公司的双色荧光22q11探针和相应试剂盒为检测工具，探针与变性后标本片的杂交结合位点为TUPLE1：22q11；ARSA：22q13。二者的荧光信号分别为红色和绿色，是彼此的内对照探针，而TUPLE1与ARSA互为内对照基因。以荧光显微镜记录最终结果，通过FISH图像分析处理系统采集染色体核型与荧光信号。

1.3 判定标准 FISH检查后进行镜检，随机选择100个左右中期分裂状态的细胞进行观察，细胞内有绿色荧光标记的是22号染色体，若22号染色体上还可见2个红色荧光信号，说明22q11无缺失；若只见一个红色荧光信号，说明存在22q11微缺失。因此，判定结果为：若90%以上细胞内各有2个红、绿荧光信号(图1)，可判定为FISH检查呈阴性，胎儿不存在22q11缺失；若有60%分裂状态细胞出现1个红色荧光信号、2个绿色荧光信号(图2)，可判定FISH检查呈阳性，胎儿存在22q11微缺失。

图1 FISH检查阴性结果

图2 FISH检查阳性结果

1.4 统计学处理 采用SPSS19.0软件对所得数据进行描述性统计学分析。

2 结 果

2.1 常规染色体核型分析结果 对所有产妇的羊水细胞进行常规染色体核型分析后显示未检测到染色体微缺失、核型分析均无异常，可排除可能存在的染色体异位、数目异常等染色体畸变。

2.2 FISH检查结果 24例曾生产或引产过一个CHD或面部畸形胎儿的孕妇，本次妊娠的彩色多普勒超声检测中未显示异常；FISH检查结果显示超过90%细胞内有2个红2个绿荧光信号，说明不存在22q11微缺失。23例产前彩色多普勒超声检测显示胎儿有心脏畸形的孕妇，施行FISH检查的产前诊断，结果显示，20例患者有90%细胞内呈现2个红2个绿荧光信号，说明不存在22q11微缺失，另3例有60%以上细胞呈现1红2个绿荧光信号，说明存在22q11微缺失；5例超声检测怀疑胎儿有唇、腭裂的病例产前诊断FISH检测结果显示有2个红2个绿荧光信号，不存在22q11微缺失。得出FISH检查结果后，对于证实有22q11微缺失的阳性患者，孕妇及其家属同意进行引产手术，而其他患者出于个人考虑作出了活产与引产的决定，详细检查和随访结果见表1。

表1 52例孕妇产前FISH检查及随访结果表(n)

3 讨 论

CHD是导致新生儿缺陷或死亡的主要原因，病因复杂。目前少数确证的病因之一认为它是一种多基因遗传病，是22q11微缺失综合征的主要表型[8-9]。CHD治疗困难，目前只能通过手术治疗，但花费巨大，为患儿带来身体的痛苦，更可能造成家庭严重的经济负担。因此，通过产前诊断筛选，确定胎儿是否患有CHD，根据产前诊断结果对胎儿的预后进行更准确、合理评估十分重要。但以往检查方法中，若超声检查显示胎儿心脏有畸形或其他畸变，通常只进行常规的染色体核型分析，分析无异常便判定胎儿未患CHD。胎儿出生后，进一步检查发现患有22q11微缺失综合征，该疾病会造成人体多个系统、器官的缺陷，包括CHD、唇裂和腭裂、心胸发育不良、认知障碍、免疫力低下等[10]。这显示了染色体核型分析法在CHD产前诊断上精确性不足的问题，因此目前普遍引进并采用分辨率、准确性更高，敏感度、特异性更强的FISH检查法进行CHD产前诊断[11]。

22q11微缺失是指22号染色体长臂1区1带2亚带内22q11.21～22q11.23这一固定区域的杂合性缺失，与CHD密切相关。22q11微缺失综合征的新生儿患病率在1/6 000～1/4 000且不同性别患病率无显著差异，该综合征会导致多种生理缺陷，涉及多个重要脏器，包括心脏畸形、面部异常、唇裂和腭裂、胸腺发育不良等，且随着疾病进展，患儿的认知学习能力、精神状态、身体发育等都会出现异常或迟缓；临床表型主要有CHD、圆锥动脉干-面部异常综合征、腭-心-面综合征(VCFS)及迪格奥尔格综合征。现今仍没有关于遗传病的有效治疗手段，从优生优育角度出发，防止患重大先天性疾病患儿的出生是主要手段，而准确、有效的产前诊断是降低患病患儿出生率的重要方法。

目前研究指出22q11微缺失主要是由于染色体在减数分裂后期进行重组时出现了不对称等异常现象造成的，该微片段的缺失会造成新生儿多方面的身体缺陷，主要包括DiGeorge综合征、锥干型心脏畸形、VCFS等，其他22q11缺失的表型还有低血钙症、免疫功能低下等。22q11微缺失片段在D22S427/1638到D22S306/308区间内，片段大小1.5～3.0 Mb，小于染色体核型分析的分辨率下限5 Mb，因此需要分辨率更高的技术手段才能进行检测[12]。FISH检查法通过特异性探针与羊水细胞杂交，检测TUPLE1基因，可用于判定胎儿是否存在22q11微缺失，可为22q11微缺失CHD疑似胎儿的产前诊断提供更可靠的检测依据，为遗产咨询、优生优育提供参考，有利于下一步及时的临床干预和风险评估。

本研究中的52例孕妇羊水细胞的染色体核型分析均显示无异常，而FISH检查有3例呈阳性，阳性病例中有2例是室间隔缺损的指征，说明22q11微缺失可能与胎儿心脏室间隔缺损有较大相关性，最终阳性病例均选择了引产终止妊娠。另20例彩色多普勒超声显示胎儿有心脏畸形、22q11微缺失高风险的病例最终FISH检测结果呈阴性，说明CHD是多基因遗传与环境因素共同作用的结果，未来还需对CHD的病因进行更深入的分析以指导诊断与治疗[13]。目前对于患有22q11微缺失综合征新生儿的治疗方法有手术治疗心脏畸形，手术整形、矫正腭及面部异常，加强补钙治疗低血钙症，存在语言、认知、行动发育缓慢者，应及时进行早教干预加以控制，以期慢慢得到改善。

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Application of FISH in the prenatal diagnosis of congenital heart disease

ZHAOJing,HUANGXiang,LIHong-yan,LIANGShao-xia

(PrenatalDiagnosisCenter,BoaiHospitalofZhongshanCity，Zhongshan，Guangdong528400,China)

Objective To investigate the detection of 22q11 micro-deletion by FISH in the prenatal diagnosis of congenital heart disease.Methods 52 pregnant women admitted to Boai Hospital of Zhongshan City during March 2012 to October 2014 who were suspected pregnancy 22q11 micro-deletion fetuses were received conventional chromosome karyotyping and FISH test for prenatal diagnosis about 22q11 micro-deletion,then were followed up.Results None of the karyotype analysis results showed abnormal,while there were 3 positive cases tested by FISH.Conclusion Karyotype analysis cannot detect 22q11 micro-deletion syndrome,hence FISH should be used in the prenatal diagnosis for fetuses with the risk of congenital heart disease caused by 22q11 micro-deletion,which can improve the accuracy of detection.

22q11 micro-deletion;FISH;congenital heart disease;prenatal diagnosis

赵婧，女，本科，主管检验师，主要从事细胞遗传学临床研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.23.025

A

1672-9455(2015)23-3512-03

2015-04-02

2015-06-29)