海藻酸钠-壳聚糖复合纤维材料的制备和表征

王建政,朱玉霞

（1.车用生物燃料技术国家重点实验室工程材料研究室,河南南阳473000；2.河南天冠企业集团试验中心,河南南阳473000）

海藻酸钠-壳聚糖复合纤维材料的制备和表征

王建政1,2,朱玉霞1,2

（1.车用生物燃料技术国家重点实验室工程材料研究室,河南南阳473000；2.河南天冠企业集团试验中心,河南南阳473000）

由于制备工艺的原因,目前的海藻酸-壳聚糖复合纤维支架中均含有可以引起体内炎症反应的海藻酸钙成分.在考察海藻酸钠和壳聚糖溶液流变学性质的基础上,设计出一种不含钙离子的海藻酸-壳聚糖复合纤维支架制备技术,即在适当条件下,将壳聚糖溶液注射进入流动着的海藻酸钠溶液中,被剪切拉伸的液丝固化形成海藻酸-壳聚糖复合纤维.还对海藻酸-壳聚糖复合流纺纤维进行了理化性质表征,证实了纺丝纤维中壳聚糖的质量分数高达45%以上,冷冻干燥的海藻酸-壳聚糖复合流纺支架可以在体外细胞培养体系中稳定存在4周以上,预示着其在医学材料领域的应用价值.

海藻酸钠；壳聚糖；丝状支架；三维培养

海藻酸钠（alginate）是一种由α-L-古洛糖醛酸和α-D-甘露糖醛酸聚合而成的天然线性高分子多糖类[1]；壳聚糖（chitosan）是甲壳素经脱乙酰化后的产物,是一种N-氨基葡萄糖与乙酰氨基葡萄糖的共聚物[2].海藻酸钠和壳聚糖生物相容性良好,已经广泛应用于生物医学和生物工程领域,其中也包括用来制作组织工程支架[3-7].由于壳聚糖和海藻酸钠之间可以发生聚电解质络合反应,海藻酸-壳聚糖复合物具有比两者单独成分更稳定、更容易保持形状等优点,因而许多研究者制备出了海藻酸-壳聚糖复合材料用于组织工程细胞的3D培养等[8].

纤维状多孔支架具有空间连通性较高、有利于养分传质和细胞迁徙、机械性能优良等特点,被广泛用于组织工程细胞的3D培养等研究领域.关于海藻酸钠-壳聚糖复合纤维制备技术,目前见诸报道的只限于将海藻酸钠溶液注入含有壳聚糖的凝固浴中,然后拉伸成型的湿纺法[9].因为断丝现象的发生,拉伸效率和纺丝效率受到了极大的影响.而且由于凝固浴中壳聚糖分子向海藻酸钠纺丝溶液内部的渗透性较差,使得最后的纺丝产品中壳聚糖的质量分数偏低（大都低于15%）.这意味着纤维中壳聚糖的质量分数低于相应的海藻酸钠当量,剩余有大量游离的海藻酸钠分子,因而纺丝产品不能在水溶液中稳定存在.Steplewski等通过在海藻酸钠纺丝液中添加高质量分数聚乙烯吡咯烷酮（16%）的方法来促进壳聚糖的渗透作用,但纺丝纤维中的壳聚糖也只达到24%[10]；如果通过降低凝固液中壳聚糖相对分子质量的方法来增加渗透,也只能使纺丝产品中壳聚糖的质量分数达到25%左右,而且纺丝产品脆性大,易碎裂[3].

为了提高纺丝产品在溶液中的稳定性,已有的湿法纺丝都添加了氯化钙（CaCl2）溶液凝固浴程序,使纤维中游离的的液态海藻酸钠转化为海藻酸钙凝胶结构,以增加纺丝产品在溶液中的稳定性.但是,许多研究表明,海藻酸钙支架对体内细胞的生长具有明显毒性作用[11-15],而且能够引起显著的炎症反应[16-17].究其原因,研究者认为是因为来自海藻酸钙支架逐渐解离的钙离子诱导了支架周围炎症的发生[11,18].因此,如果能够探索出一种不含海藻酸钙的海藻酸-壳聚糖复合纤维制备技术,将对海藻酸-壳聚糖复合纤维支架的体内应用起到重要的推动作用.

本文从制备不含海藻酸钙的海藻酸-壳聚糖复合纤维支架入手,设计一种不使用钙离子溶液的海藻酸-壳聚糖复合纤维制备新技术,并进行工艺确定和优化,对制备的海藻酸-壳聚糖复合纤维的化学组成和稳定性等理化性质进行表征.

1 材料与仪器

海藻酸钠（G/M=0.5）,山东金燕科技开发有限公司；壳聚糖（DD=95%）,浙江玉环海洋生物制品有限公司；Fluorescein isothiocyanate（FITC）,美国Amresco公司；Milli-Q Biocel超纯水系统,密理博中国有限公司；RET control visc IKAⓇ-WERKE加热磁力搅拌器,德国IKA集团；微孔滤膜（混合纤维塑膜）,上海市新亚净化器厂；FD-1冷冻干燥机,北京博医康技术公司；Razel A-99注射泵,美国Razel科技设备有限公司；Nikon Eclipse TE2000倒置显微镜,日本尼康公司；JSM-5600 LV扫描电镜,日本Nippon Denki公司；SMZ800体视显微镜,日本尼康公司；Leica TCS SP2激光共聚焦显微镜,日本Leica microsystem公司；电子分析天平（JA5003）,上海天平仪器厂；傅里叶变换红外光谱仪（Vector 22）,德国Bruker光学仪器公司；元素分析仪（Elementar Vario EL-II）,德国 Analysensysteme GmbH公司；X-射线衍射仪（RINT D/max-2500/PC）,日本Rigaku公司；热分析仪（Setsys 16/18）,法国Setaram公司；MEM培养基（Minimum Essential Medium）,美国Gibco公司；新生牛血清（New born calf serum）,杭州四季青公司；胰酶（Trypsin）,美国Amresco公司；细胞培养板（24孔）,珀金埃尔默仪器（上海）有限公司；扫描电镜（JSM-5600 LV）,日本Nippon Denki公司；微波炉（800 W～1 300 W）,青岛海尔集团.

其他所需试剂为国产分析纯.

2 试验方法

壳聚糖的FITC荧光标记：称取1.0 g壳聚糖粉末,搅拌溶于100 mL醋酸缓冲溶液（11.8 mL冰醋酸+ 8.2 g醋酸钠,定容至1 000 mL,pH 4.1～4.4）中,用1.0 mol/L NaOH调至pH 6.5～7.0；称取6 mg FITC（异硫氰酸荧光素）,溶于4.0 mL甲醇.将上述两种溶液混合,常温避光搅拌13 h反应,然后滤纸过滤,用50%乙醇反复洗涤沉淀至中性.最后100%乙醇洗涤沉淀,真空避光冷冻干燥.

壳聚糖溶液配制：称量1 g壳聚糖粉末,搅拌溶于100 g醋酸缓冲溶液（11.8 mL冰醋酸+8.2 g醋酸钠,定容至1 000 mL）中.继续搅拌30 min后,依次经孔径0.8 μm、0.45 μm和0.22 μm微孔滤膜过滤,然后用去离子水分别依次稀释至所需质量浓度.试验使用的壳聚糖粘均相对分子质量为230 kDa,壳聚糖质量浓度为0.333 g/L、0.250 g/L和0.200 g/L.

海藻酸钠溶液配制：称量1 g海藻酸钠粉末,搅拌溶于100 g去离子水（R=18.2 MΩ/cm）中.继续搅拌3 h后,依次经孔径0.8 μm、0.45 μm和0.22 μm微孔滤膜过滤,然后用去离子水稀释至所需质量浓度.试验使用的海藻酸钠粘均相对分子质量为595 kDa,海藻酸钠的质量浓度为10 g/L.

纤维制备：将壳聚糖溶液装入附有特定型号针头的医用注射器,用Razel A-99注射泵控制流量,将壳聚糖溶液注射进入搅拌着的海藻酸钠溶液中.搅拌转速1 000 r/min；注射流量35.7 mL/h；针头孔径450 μm.用一根不锈钢长针头插入烧杯,搜集纤维（见图1）.将纤维转入另一个盛有去离子水的烧杯中水洗,再次搜集；依次水洗3遍后,将纤维搜集置入6孔培养板中进行冷冻干燥.

图1 纤维水洗与搜集示意Fig.1 Scheme of rinsing and collecting of fibers

纺丝样品处理和拍照：

（A）获得纺丝样品后,在载玻片上滴一滴清水,放上适量的纺丝样品（需要干燥时采用冷冻干燥后的纺丝样品）,放在倒置显微镜下或激光共聚焦显微镜下（488 nm/515 nm）观察和拍摄照片；

（B）在载物台上放上适量的、冷冻干燥的纺丝样品,放在体视显微镜下观察和拍摄照片；

（C）将冷冻干燥的纺丝样品用导电胶布粘在载物台上,在扫描电镜下观察拍照.

红外谱图测定步骤：所有待测样品均经乙醇梯度洗涤（0%、20%、40%、60%、80%、100%,经pH值中性去离子水配制）、脱水和干燥.将干燥的样品加入KBr充分研磨后压片,在红外光谱仪上记录其谱图,扫描范围为500～4 000 cm-1.

元素分析（N、C、H）：将干燥的样品研磨成粉末,在元素分析仪上1 800℃燃烧,测定元素N、C、H的质量分数,并计算N/C比和壳聚糖的质量分数.壳聚糖质量分数计算采用式（1）.

X-线衍射光谱：将干燥的样品（壳聚糖质量浓度为0.333 g/L）用粉末机压片,在X-线衍射以上扫描,电压40 kV,电流100 mA,Cu kα（0.154 nm）谱源,扫描角度5°～40°,扫描速度5°/min.

热谱分析：将10 mg真空干燥的样品压进标准氧化铝瓷坩埚,在25～350℃范围内对样品进行热重分析（Thermogravimetric analysis,TG）、微分热重分析（Differential Thermo-Gravimetric analysis,DTG）和差式扫描量热分析（Differential Scanning Calorimetric analysis,DSC）.升温速率：10℃/min.升温测定过程中,以20 mL/min的流量通氩气进入坩埚作为保护气.

纤维在培养基中的稳定性分析实验：在24孔培养板中接入MEM培养基（含10%血清）和MCF-7细胞（0.5×106cells/cm2）,在37℃、5%CO2条件下无菌培养3 h.在另一24孔培养板中放入干燥的纤维样品（每孔约0.01 g,在微波炉中加热灭菌3 min.冷却后每孔接入2 mL前述的经过细胞培养的MEM培养基,在37℃、5%CO2条件下无菌培养.30 d后,将纤维样品捞出,经过PBS溶液（pH 7.4）漂洗和乙醇梯度脱水（0%、20%、40%、60%、80%、100%）后冷冻干燥,在扫描电镜（SEM）下观察拍照.对照组采用MEM培养基对纤维样品简单漂洗后冷冻干燥,然后SEM观察.

3 结果与讨论

3.1 流体纺丝的基本原理

根据液滴及液丝变形理论,设计了一种纺丝方法：将分散相溶液（如壳聚糖溶液）注射进入流动相溶液（如海藻酸钠溶液）中,两种溶液反应形成固化的复合丝状物（如海藻酸-壳聚糖聚电解质复合纤维）,在这里称之为“流体纺丝”（Hydro-spinning）（见图2）,简称“流纺”.

图2 流体纺丝示意Fig.2 Scheme of hydro-spinning

图3 流纺纤维的形态Fig.3 Morphology of hydro-spun fibers

流体纺丝的原理在于分散相溶液在接触连续相溶液时,被流动着的连续相剪切拉伸成条带状,其变形动力的来源在于两种溶液接触面间的摩擦力,被拉伸的液丝因为连续相和分散相之间发生凝固反应而在其断裂成碎片前固定成型.

3.2 流体纺丝纤维的形态

将合适浓度的壳聚糖溶液作为分散相,注射进入流动着的海藻酸钠溶液中,可以纺出丝状产物（见图3-C）,在共聚焦显微镜下呈绿色荧光条带（见图3-F）,说明纺丝纤维中含有荧光标记的壳聚糖分子.干燥后纤维样品在体视显微镜下呈乳白色海绵状（见图3-D）,在光学显微镜下呈丝带状（Ribbon-like）（见图3-A和图3-B）,在扫描电镜（SEM）下呈薄片状（见图3-E）,说明纺丝纤维具有比较高的比表面积.

3.3 流纺纤维的化学组成

3.3.1 红外表征 海藻酸钠是一种阴离子高分子聚合物,而壳聚糖是一种阳离子高分子聚合物.海藻酸钠离解的羧基基团-COO-与壳聚糖的质子化基团-NH3+之间的静电吸引作用可以使两者形成海藻酸-壳聚糖聚电解质复合物（见图4-A）[11-14].Lawrie等人报道：该复合物形成后,其FTIR图谱将在1 530 cm-1附近有一个属于质子化的胺基（+H3N-）的特征吸收峰[19],依此可以判断海藻酸-壳聚糖离子键（-COO-…+H3N-）的形成.海藻酸-壳聚糖流纺纤维样品的FTIR图谱如图4-B所示,纤维样品（F0.333,F0.250和F0.200分别代表使用的壳聚糖质量浓度为0.333 g/L、0.250 g/L和0.200 g/L）的FTIR图谱在1 531 cm-1处均有一个特征峰,而原料海藻酸钠（A595）、壳聚糖（C230）及二者物理混合物（ACmix）均不具有该特征峰,这说明流纺纤维中,海藻酸钠与壳聚糖之间存在着离子键作用.这种离子键作用将使得海藻酸-壳聚糖复合物支架对于pH变化比单独的海藻酸钠或壳聚糖支架更稳定[20-21],更适于在细胞培养基中保持一定的物理形态.同时,海藻酸-壳聚糖离子键的形成可以破坏海藻酸钠和壳聚糖原有分子的晶型结构,更有利于复合物支架的生物降解.

图4 红外吸收光谱与海藻酸钠/壳聚糖之间的化学键Fig.4 FTIR and chemical bonds between alginate and chitosan

3.3.2 元素分析 试验中选用了壳聚糖质量浓度为0.200 g/L、0.250 g/L、0.333 g/L的流纺纤维样品进行化学元素分析（Elementary analysis）,其结果如表1所示,对应于壳聚糖质量浓度为0.200 g/L、0.250 g/L、0.333 g/L的纤维样品（依次分别为WDAC0.200,WD AC0.250和WD AC0.333）的壳聚糖质量分数分别为（46.5± 3.1）%、（49.0±1.9）%和（54.4±1.3）%.可以看出,随着壳聚糖质量浓度的增加,复合纤维中的壳聚糖质量分数也在不断增加.尽管有许多研究者进行了海藻酸钠/壳聚糖复合湿法纺丝的研究,但湿法纺丝纤维中的壳聚糖质量分数普遍低于15%.具有高壳聚糖质量分数的支架更利于调节细胞的贴附生长[22].此外,由于人体内富含降解壳聚糖的生物酶,高壳聚糖质量分数也会更利于支架的可控降解.

表1 流纺纤维成分的元素分析结果（平均数±SD,n=4）Tab.1 Element analysis data of WD fibers and pure materials（Data showed as mean±SD,n=4）

3.4 流纺纤维的晶型和热力学稳定性分析

3.4.1 晶型分析 将海藻酸钠、壳聚糖原料及流纺纤维样品分别进行XRD（X-ray diffraction）检测,其结果如图5所示.

图5 海藻酸钠,壳聚糖及海藻酸-壳聚糖复合纤维的XRD图谱Fig.5 XRD spectra of alginate,chitosan and alginate/chitosan complex fibers

由图5可知,壳聚糖在2θ=10.4°和2θ=20°处各有一个衍射峰（图5-a）,这与文献结果相一致[23-24]；海藻酸钠在2θ=13.6°和2θ=21.5°处各有一个衍射峰（图5-b）,这也与文献结果相一致[25-26].海藻酸-壳聚糖复合纤维在12.5°与22.5°之间有一大跨度的平坦宽峰（图5-c）,这说明在复合纤维内,海藻酸钠和壳聚糖的晶型结构被二者之间的离子键所打破,继而形成了更多的无定型复合主体结构[27],同时也说明了海藻酸钠、壳聚糖两种成分在流体纺丝过程中混合的均匀性.

海藻酸-壳聚糖复合流纺纤维样品的无定形结构的增加,意味着海藻酸钠和壳聚糖大分子链之间的离子键会破坏它们各自分子链内的微小晶区,因而有利于增加材料的柔韧性,减小脆性.同时,这两种高聚物的分子链总体上会在流体纺丝过程中沿拉伸方向上进一步取向排列,因而有利于增加流纺纤维材料的抗拉伸强度等性能.

3.4.2 热谱分析 对流纺纤维及原料海藻酸钠、壳聚糖的热动力学性质进行分析测定,结果如图6所示.

图6 海藻酸钠,壳聚糖及海藻酸-壳聚糖复合纤维的热谱分析Fig.6 Thermal analysis of alginate,chitosan and alginate/chitosan complex fibers

由图6可知,有93.25和104.77℃两个吸热峰（即负的热流）（图6-A）,此时伴随着样品质量的减少,即DTG曲线为负值,TG下行.因此,这两个吸热峰可能分别来源于壳聚糖中自由水和结合水的释放[28-29].此外,在300.18℃附近伴随着样品的质量损失（DTG为负值,TG曲线下行）,壳聚糖的DSC图谱还有一个明显的放热峰,此时可能是由于壳聚糖样品因受到高温而发生放热降解反应（Pyrolyticdecomposition）[29].海藻酸钠原料样品在97℃和235℃附近各有一个失重过程（DTG为负值,TG曲线下行）（图6-B）,所不同的是,在97℃时为吸热失重（即DSC为负值）,而在235℃时为放热失重（即DSC为正值）,因此这两个峰可能分别代表失水和热降解过程[30].此外,海藻酸钠的热动力曲线在135℃和200℃之间有一段宽阔平坦的吸热过程（DSC为正值）,在此过程中样品没有明显的失重（即DTG和TG曲线基本呈水平状态）,此过程可能对应着海藻酸钠样品的玻璃化转变过程（Glass transition）[31-32].在94℃和211℃显示两个明显的吸热峰（图6-C）,这两个吸热峰伴随失重过程（DTG为负值,TG曲线下行）,因此可能对应着样品失去自由水和结合水的过程.此外,在280℃附近有一个放热失重过程（DSC正值,DTG负值,TG曲线下行）,这时可能对应着样品的高温共价键断裂降解过程.

3.5 流纺纤维在培养基中的稳定性

试验对海藻酸-壳聚糖复合流纺纤维在体外细胞培养体系中的稳定性进行了检测,结果如图7所示.海藻酸-壳聚糖复合流纺纤维在体外细胞培养体系的MEM培养基中能稳定存在4周以上（图7-B）,且其物理形态基本保持不变,这说明海藻酸-壳聚糖流纺纤维可以用来尝试作为体外细胞培养的3D支架材料.图7-A显示的是MEM简单漂洗后即冷冻干燥的对照材料.

图7 海藻酸-壳聚糖复合流纺纤维在培养基中的稳定性Fig.7 Stability of alginate/chitosan hydro-spun fibers in MEM

4 小结

在适当条件下,将壳聚糖溶液注射进入流动着的海藻酸钠溶液中,两种溶液可以发生反应,并拉伸、固化成纤维状复合物.通过对海藻酸-壳聚糖流纺纤维的理化表征证明：在纺丝过程中,海藻酸钠与壳聚糖发生了静电络合作用,形成了不溶于水的海藻酸-壳聚糖聚电解质复合带状纤维；纺丝产物中壳聚糖与海藻酸钠的反应充分、混合均匀,壳聚糖的质量分数可达45%以上；经过充分干燥的纤维在溶液的稳定性大大增强,可以在体外细胞培养体系中稳定存在4周以上.上述特征表明,该复合材料在组织工程等领域有着潜在的应用前景.

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（责任编辑：卢奇）

Fabrication and characterization of alginate-chitosan hybrid fibers

Wang Jianzheng1,2,Zhu Yuxia1,2
（1.Group of Material Engineering,State Key Laboratory of Bio-fuel Technology for Vehicle.Nanyang 473000,China；2.Testing Center of Henan Tianguan Group Co.,Ltd.,Nanyang 473000,China）

Traditional wet-spun alginate-chitosan fibrous scaffolds contain calcium ions,which would induce inflammations in applications in vivo.A novel technology for the fabrication of non-calcium alginate-chitosan hybrid fibrous scaffold for three-dimensional cell culture was described in this paper.On the basis of rheological characters of alginate and chitosan solutions,a method was designed to fabricate alginate-chitosan hybrid fibers.Under certain operating conditions,chitosan solution was injected into the flowing alginate solution,and was sheared into streamlines. The streamlines then solidified into fibers before breaking into pieces.In addition,the physical and chemical properties of alginate-chitosan fibers were also investigated.It was verified that alginate-chitosan polyelectrolyte complex （PEC）formed during the process of hydro-spinning,and the content of chitosan reached more than 45%of the fibers.Freezing dried fibers could retain their integrity in the MEM up to 4 weeks.

alginate；chitosan；fibrous scaffold；three-dimensional cell culture

TQ460.1

A

：1008-7516（2015）04-0048-08

10.3969/j.issn.1008-7516.2015.04.010

2015-06-06

王建政（1971―）,男,河南平顶山人,博士,工程师.主要从事生物医学材料研究.