结核感染T细胞检测在儿童骨关节结核病中的诊断价值

贾晨光，姚黎明＊，李秀武，刘丰胜，章志华，张金文

（1.河北省胸科医院骨科，河北 石家庄050041；2.河北省胸科医院病理科，河北 石家庄050041；3.河北省胸科医院科教处，河北 石家庄050041）

结核病（tuberculosis，TB）的诊断及控制是全球公共卫生面临的难题。目前我国仍然是儿童结核感染发病率及病死率较高的发展中国家之一［1］。根据世界卫生组织公布的资料，2006年全球结核病例新增800万，儿童病例约130万，其中10%～20%为肺外结核［2］。骨关节结核是结核病在肺外器官最常见的类型，约占结核病总人数的13%左右，好发于儿童和青少年。对结核分枝杆菌感染患者的快速诊断及成功治疗是遏止结核病广泛并快速传播的核心步骤。在临床工作中，准确诊断儿童早期骨关节结核病尤为困难。目前国内关于结核感染T细胞斑点试验（tuberculosis infection of T cells spot test，TSPOT.TB）应用于儿童活动性结核诊断中的研究报道数量较少。本研究旨在评估T-SPOT.TB诊断儿童骨关节结核病的临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2011年10月—2014年10月河北省胸科医院骨科收治的诊断为骨关节结核的患儿36例，男性26例，女性10例，年龄7个月～14岁，平均（7.40±4.27）岁。参考中华医学会《临床诊疗指南》结核病分册相关诊断标准，根据病史、临床特点、影像学表现、组织病理学、病原学检查结果以及抗结核治疗效果进行诊断。见表1。

表1 36例骨关节结核患儿临床资料统计Table 1 Clinical characteristics of 36children patients confirmed with osteoarticular tuberculosis（n＝36，例数，%）

1.2 方法 所有患儿分别进行涂片抗酸染色、结核菌培养、实时荧光定量PCR检测、结核菌素PPD试验、T-SPOT.TB，比较其阳性检出率。根据病变部位（脊柱／四肢关节）及年龄段（年龄≤3岁，＞3～6岁，＞6～9岁，＞9～14岁）分别比较T-SPOT.TB阳性检出率。

1.2.1 涂片抗酸染色 所有诊断为骨关节结核病患者的标本处理均依据“中国防痨协会指导方针”［3］进行。将采集的关节腔积液、病灶脓液标本，经离心沉淀集菌后，用少量生理盐水混匀沉淀物，均匀涂抹于载玻片上，自然干燥后，行抗酸染色镜检。

1.2.2 结核菌培养 将采集的关节腔积液、病灶脓液标本经消化处理后，接种于罗氏培养基上，37℃培养，接种后3d、7d观察，此后每周观察1次，有菌落生长后用抗酸染色验证，若同时为阳性记录为阳性，否则为阴性，至第8周仍无细菌生长记录为阴性。

1.2.3 实时荧光定量PCR检测 活检或手术标本采用荧光定量试剂盒检测结核分枝杆菌DNA，具体操作按试剂盒说明书进行。标本经去污和离心后，得到50μL DNA提取液，混匀后沸水煮10min，4℃放置6～8h。离心10 000r／min 5min，取上清用于实时荧光定量PCR检测。

1.2.4 结核菌素PPD试验 注射0.1mL（5U）于患儿的前臂掌侧皮内，72h观察注射部位的反应情况。评价标准参照“中国结核病防治规划实施工作指南（2008版）”标准［4］：硬结直径（d）＜5mm 为阴性（-）；5～10mm 为弱阳性（＋）；＞10～20mm为阳性（＋＋）；＞20mm或局部出现水泡、坏死或有淋巴炎为强阳性（＋＋＋）。

1.2.5 T-SPOT.TB 受试者用肝素锂抗凝采血管抽取5mL静脉血，即刻轻柔颠倒混匀3～5次，使抗凝剂充分溶解。3h内将采集的全血分装到3种不同的培养管中，“T”为添加了结核特异性抗原早期分泌抗原靶蛋白6、培养滤液蛋白10的测试培养管，“N”为本底对照培养管，“P”为添加了非特异刺激原植物血凝素的阳性对照培养管，每种培养管分装1mL，分装前需要颠倒混匀3次以上，分装后轻柔颠倒培养管5次并立刻置于37℃培养箱中，静置培养（22±2）h后取出，离心收集上清液，然后用双抗体夹心法定量检测上清中γ干扰素的含量，最后计算刺激培养系统中特异性升高的γ干扰素的量来判定是否为结核杆菌感染阳性。

1.3 统计学方法 应用SSPS 14.0统计软件进行数据分析，计数资料以百分率表示，采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各种检测方法阳性检出率比较 T-SPOT.TB阳性检出率（75.00%，27／36）显著高于涂片抗酸染色阳性检出率（8.33%，3／36）、结核菌培养阳性检出率（50.00%，18／36），差异有统计学意义（P＜0.05或＜0.01）；略高于实时荧光定量PCR检测阳性检出率（61.11%，22／36）及结核菌素PPD试验阳性检出率（66.67%，24／36），但差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 T-SPOT.TB与其他临床常用检测方法阳性检出率比较Table 2 The positive rate of T-SPOT.TB in comparison with other commonly used clinical methods （例数）

2.2 不同病变部位及年龄段T-SPOT.TB阳性检出率比较 36例骨关节结核患儿中包括22例脊柱结核和14例关节结核患儿，T-SPOT.TB诊断脊柱结核的阳性检出率高于四肢关节结核，但差异无统计学意义（P＞0.05）。36例骨关节结核患儿中年龄≤3岁10例，＞3～6岁4例，＞6～9岁6例，＞9～14岁13例，4个年龄段T-SPOT.TB阳性检出率差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 不同病变部位和年龄段T-SPOT.TB阳性检出率比较Table 3 The positive rate of T-SPOT.TB for different locations and age stages of osteoarticular tuberculosis（例数，%）

3 讨 论

目前结核病在全球已呈现明显回升趋势，儿童病例数亦有显著增加。在临床实际工作中时常会遇到令医师尴尬的现象，即依临床体征、影像学表现高度怀疑骨关节结核病变，并有红细胞沉降率增快、C反应蛋白增高，但结核菌素试验、结核抗体和穿刺液涂片、TB-DNA、结核菌培养等结核方面的特异性检验结果均为阴性，甚至手术后病理结果仅提示慢性感染。由于抗结核药物治疗是一个漫长的过程，一旦在误诊的条件下实施药物治疗，不仅会增加药物不良反应的危险，骨关节破坏性病变也势必加重，甚至产生不可修复的损害。在缺乏诊断结核病的细菌学或病理学证据的前提下能否给予接受试验性抗结核药物治疗是摆在医师与患儿家长面前无法回避的共同难题。查阅文献资料并结合我们的临床工作体会，造成早期儿童骨关节结核病诊断困难的原因可归纳为：①我国儿童普遍预防接种了卡介苗，机体对结核感染有一定抵抗能力，故早期儿童骨关节结核的临床和影像学表现都不很典型；②患儿多为学龄前期儿童，故难于获得准确主诉甚至无主诉，增加了诊断上的困难；③儿童骨关节结核病灶内载菌量较低，故相应组织学及病原学获得阳性结果较为困难［5］。

回顾以往传统检测方法各有不足：抗酸染色检测法的阳性率非常低，在本次研究中为8.33%（3／36）；被认为是结核病临床诊断“金标准”的结核菌培养，因耗时长（6～8周）、阳性率低，而使其应用受到限制；且以上检测均为侵袭有创性操作，意味着患儿需承担相应痛苦及风险［6-7］。可见以上方法对于筛选儿童骨关节结核病并不是最理想的选择。

由于原有的结核诊断方法存在自身无法克服的缺陷，T-SPOT.TB给现代临床医学带来快速、特异、灵敏准确的结核感染诊断方法。目前，欧洲、加拿大、美国均已审批应用，成为替代诊断结核感染的最主要方法［8］。该方法的基本原理是：当体内曾经受到结核分枝杆菌抗原刺激而致敏的T淋巴细胞再次遇到同类抗原时能产生γ干扰素。通过进行T-SPOT.TB，从单细胞水平检测分泌γ干扰素的细胞数目，准确判断机体是否存在结核感染，辅助诊断结核病。

本研究TB-SPOT.TB阳性检出率为75.00%，与我们之前系列研究中报告的82.5%接近［9］，且在不同年龄段、不同病变部位（脊柱／四肢关节）间阳性检出率差异无统计学意义，体现出对诊断各年龄段及不同病变部位的儿童骨关节结核病均有良好的一致性。与上述传统检查相比，TB-SPOT.TB优势体现在：①敏感度高，TB-SPOT.TB明显优于抗酸染色、结核菌培养；②快速安全简便，简单的血液检测，隔天即报告结果，可避免对患儿造成创伤，特别是在病灶取活检困难或外科手术指征不充分时；③特异性好，TB-SPOT.TB利用了结核分枝杆菌所特有的抗原靶6和培养滤液蛋白作为抗原刺激诱发免疫应答反应，只针对结核分枝杆菌复合群敏感，对大多数环境分枝杆菌和卡介苗无交叉反应，而PPD是多种蛋白成分的混合物，其容易受到接种卡介苗和环境分枝杆菌感染的影响，诊断结核分枝杆菌感染和结核病特异性相对较低［10］。

综上所述，T-SPOT.TB作为一种新的诊断技术，在儿童骨关节结核病的临床诊断中具有较好的应用价值，有助于探索并建立诊断儿童骨关节结核病的新方案。

［1］ Zar HJ.Tuberculosis in the developing world［J］.Pediatr Pulmonol Suppl，2004，26：53-54.

［2］ Rajasekaran S，Prasad Shetty A，Dheenadhayalan J，et al.Morphological changes during growth in healed childhood spinal tuberculosis：a 15-year prospective study of 61children treated with ambulatory chemotherapy［J］.J Pediatr Orthop，2006，6：716-724.

［3］ 唐神结，高文.临床结核病学［M］.北京：人民卫生出版社，2011：16-17.

［4］ 卫生部疾病预防控制局和医政司，中国疾病预防控制中心.中国结核病防治规划实施工作指南（2008版）［M］.北京：中国协和医科大学出版社，2009：24-25.

［5］ 吴启秋，林羽.骨与关节结核［M］.北京：人民卫生出版社，2006：199-201.

［6］ El-Sayed Zaki M，Abou-El Hassan S.Clinical evaluation of gen-probe′s amplified Mycobacterium tuberculosis direct test for rapid diagnosis of Mycobacterium tuberculosis in Egyptian children at risk for infection［J］.Arch Pathol Lab Med，2008，132（2）：244-247.

［7］ Portillo-Gómez L，Murillo-Neri MV，Gaitan-Mesa J，et al.Nested polymerase chain reaction in the diagnosis of cervical tuberculous lymphadenitis in Mexican children［J］.Int J Tuberc Lung Dis，2008，12（11）：1313-1319.

［8］ Lee SW，Lee CT，Yim JJ.Serial interferon-gamma release assays during treatment of active tuberculosis in young adults［J］.BMC Infect Dis，2010，10：300.

［9］ 贾晨光，姚黎明，刘秀武，等.结核感染T细胞检测在骨关节结核中的诊断价值研究［J］.河北医科大学学报，2015，36（2）：148-151.

［10］ Talbot EA，Harland D，Wieland-Alter W，et al.Specificity of the tuberculin skin test and the T-SPOT.TB assay among students in a low-tuberculosis incidence setting［J］.J Am Coll Health，2012，60（1）：94-96.