HPLC-ELSD 法对多烯磷脂酰胆碱胶囊含量和有关物质检测的研究

刘婉君，黄 芃，刘晓红，徐 璐

(沈阳药科大学 药学院，辽宁 沈阳 110016)

HPLC-ELSD 法对多烯磷脂酰胆碱胶囊含量和有关物质检测的研究

刘婉君，黄 芃，刘晓红，徐 璐*

(沈阳药科大学 药学院，辽宁 沈阳 110016)

目的建立多烯磷脂酰胆碱胶囊中多烯磷脂酰胆碱含量及其有关物质溶血磷脂酰胆碱的限度检查方法。方法采用正相色谱系统串联蒸发光散射检测器按照梯度洗脱程序对多烯磷脂酰胆碱进行检测。结果多烯磷脂酰胆碱在94～1128 μg·mL-1范围内回归方程r2≥0.95；平均回收率为99%，RSD为1.7%；溶血磷脂酰胆碱在42～182 μg·mL-1范围内回归方程r2≥0.95；多烯磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰胆碱的平均回收率分别为为 99.13%和 93.79%，RSD为 1.64%和1.42%；多烯磷脂酰胆碱及溶血磷脂酰胆碱的检测限分别为19 μg·mL-1和21 μg·mL-1；定量限分别为94 μg·mL-1和42 μg·mL-1。仪器精密度RSD%≤2.0%。三批市售胶囊中主药含量分别为97.2%、100.07%和96.9%，磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇及磷脂酸未检出。结论 所建立的方法可准确地测定胶囊中多烯磷脂酰胆碱的含量并用于溶血磷脂酰胆碱的限度检查。

药剂学；HPLC-ELSD；多烯磷脂酰胆碱；含量测定

多烯磷脂酰胆碱是从大豆中分离提取的一种磷脂，具有使受损的肝功能和酶活力恢复正常、调节肝脏的能量平衡、促进肝组织再生、将中性脂肪和胆固醇转化成容易代谢的形式、稳定胆汁等生理功能[1-3]。当患肝脏疾病时肝脏的代谢活力受到严重损伤，而容易吸收利用的高能多烯磷脂酰胆碱在化学结构上与重要的内源性磷脂一致，它们主要进入肝细胞，并以完整的分子与肝细胞膜及细胞器膜相结合，另外，可分泌入胆汁，起到保肝护肝的作用。

由于多烯磷脂酰胆碱极性较大且紫外吸收为末端吸收，所以采用正相色谱连接蒸发光散射检测器，以梯度洗脱的方式进行检测分析[4-7]。本法中主药和有关物质的检测灵敏度大大提高，系统适用性好，专属性强，然而蒸发光散射检测器检测样品时，样品浓度跟峰面积不成线性，因此本文中以一元二次回归方程计算含量。在本试验条件下测定多烯磷脂酰胆碱胶囊的含量及其有关物质的检测限度，尤其是需要严格控制限度的杂质溶血磷脂酰胆碱，可获得满意的结果[8-9]。

1 仪器与试药

HITACHI 高效液相色谱仪；丙二醇键合硅胶色谱柱（Unitary Diol，4.6 mm×250 mm，5 μm，100A），Model 200es ELSD蒸发光散射检测器；AR1140电子天平。

多烯磷脂酰胆碱（自制）；溶血磷脂酰胆碱（纯度≥99%，Sigma-Aldrich）；磷脂酰乙醇胺（TLC纯度≥98%，Sigma-Aldrich）；磷脂酰肌醇（TLC纯度～50%，Sigma-Aldrich）；磷脂酸（纯度≥ 99%，Sigma-Aldrich）；多烯磷脂酰胆碱胶囊（赛诺菲-安万特）；正己烷、异丙醇（色谱纯，山东禹王实业有限公司化工分工公司）；三乙胺（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；冰醋酸（分析纯，天津博迪化工股份有限公司）；重蒸水；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：丙二醇键合硅胶色谱柱（Unitary Diol，4.6 mm×250 mm，5 μm，100A）；流动相：A)正己烷-异丙醇-冰醋酸-三乙胺（体积比为814:170:15:0.8），B)异丙醇-水-冰醋酸-三乙胺（体积比为844:140:15:0.8）；检测器：蒸发光散射检测器，蒸发室温度45oC；漂移管温度50oC；柱温：55oC；进样量：20 μL。梯度洗脱的条件见表1。

Table 1 Gradient elution condition表1 梯度洗脱条件

试验表明多烯磷脂酰胆碱主峰与溶血磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸分离度良好（见图1）。

2.2 多烯磷脂酰胆碱胶囊含量测定及其方法学研究

精密称取多烯磷脂酰胆碱94.1 mg置于50 mL容量瓶中，加入甲醇溶解稀释至刻度，即得940 μg·mL-1多烯磷脂酰胆碱储备液1；精密称取溶血磷脂酰胆碱9.1 mg置于50 mL容量瓶中，加入甲醇溶解稀释至刻度，即得182 μg·mL-1溶血磷脂酰胆碱储备液2；精密称取磷脂酰乙醇胺24.25 mg置于50 mL容量瓶中，加入甲醇溶解稀释至刻度，即得485 μg·mL-1磷脂酰乙醇胺储备液3；精密称取磷脂酰肌醇29.35 mg置于50 mL容量瓶中，加入甲醇溶解稀释至刻度，即得587 μg·mL-1磷脂酰肌醇储备液4；精密称取磷脂酸34.05 mg置于50 mL容量瓶中，加入甲醇溶解稀释至刻度，即得681 μg·mL-1磷脂酸储备液5。

2.2.1 专属性

Fig. 1 Chromatogram of impurities (a.phosphatidic acid, b.phosphatidyl ethanolamine, c.polyene phosphatidyl choline, d.phosphatidylinositol, e. lyso-phosphatidylcholine)图1 混合杂质的色谱图（a.磷脂酸b.磷脂酰乙醇胺c.多烯磷脂酰胆碱d.磷脂酰肌醇e.溶血磷脂酰胆碱）

Fig. 2 Chrom otograms of phosphatidic acid (a), phosphatidyl ethanolamine(b), polyene phosphatidyl choline(c), phosphatidylinositol (d), lyso-phosphatidylcholine (e)图2 a. 磷脂酸 b. 磷脂酰乙醇胺 c. 多烯磷脂酰胆碱 d. 磷脂酰肌醇 e. 溶血磷脂酰胆碱的色谱图

精密量取储备液1～5各20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图如图2所示。取胶囊内容物适量（2份），分别置于光照（4500 lx±500 lx）、高温（60oC）烘箱内放置一段时间后，以甲醇溶解。另取胶囊内容物适量（3份），分别加入含1 mol·L-1HCl、NaOH、H2O2的甲醇适量，摇匀，调节pH至中性。对光照、高温、酸、碱和氧化破坏样品溶液分别进行色谱分析。结果显示（图 3），在上述条件下的强烈破坏后，所得色谱峰中多烯磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰胆碱仍有较好分离。

Fig. 3 Chromatograms of commercially available capsule (a), and the capsules destroyed by acid (b), alkali (c), oxidation (d), heat (e), and light (f)图3 a. 市售胶囊 b. 酸破坏 c. 碱破坏 d. 氧化破坏 e. 热破坏 f. 光照破坏的色谱图

2.2.2 定量限与检测限

分别精密量取储备液1、2适量，进行稀释，进样至色谱图中信号噪音比值（S/N）为10时即为定量限。S/N为3时即为检测限。多烯磷脂酰胆碱的检测限和定量限分别为19 μg·mL-1和94 μg·mL-1，溶血磷脂酰胆碱的定量限和检测限分别为21 μg·mL-1和42 μg·mL-1。

2.2.3 精密度

2.2.3.1 进样精密度

取多烯磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰胆碱标准曲线制备下的中间点，及储备液3、4、5分别重复进样6次，以峰面积进行精密度考察，测得多烯磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇以及磷脂酸的精密度RSD（%）分别为1.95%、1.86%、1.89%、1.89%和1.94%。结果表明，

各物质的进样精密度良好。

2.2.3.2 重现性

分别制备6份多烯磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰胆碱溶液，进各样一次，以峰面积进行重现性考察，测得多烯磷脂酰胆碱的重现性RSD为1.88%，溶血磷脂酰胆碱的重现性RSD为1.97%。结果表明，该方法的重现性良好。

2.2.4 标准曲线

2.2.4.1 多烯磷脂酰胆碱标准曲线

分别精密量取0.5、2、3.5、5.0、6.0 mL储备液1至10 mL容量瓶中，配制质量浓度分别为94、376 、658 、940 、1128 μg·mL-1的系列溶液。分别取20 μL注入液相色谱仪，以峰面积对浓度进行一元二次回归方程拟合，结果见图4a。

2.2.4.2溶血磷脂酰胆碱标准曲线

分别精密量取储备液2适量进行稀释，配制浓度分别为42 、70 、112 、141 、182 μg·mL-1的系列溶液。分别取20 μL注入液相色谱仪，以峰面积对浓度进行一元二次回归方程拟合，结果见图4b。

Fig. 4 Sstandard curve of（a）polyene phosphatidyl choline and（b）lyso-phosphatidyl choline图4 多烯磷脂酰胆碱及溶血磷脂酰胆碱标准曲线

2.2.5 回收率

2.2.5.1 多烯磷脂酰胆碱回收率

精密称取多烯磷脂酰胆碱适量，加入空白辅料，甲醇溶解稀释制成低、中、高3个浓度的供试品溶液。各个浓度样品分别各进3针，按含量测定项下的测定方法测定供试品溶液中多烯磷脂酰胆碱的含量，并计算RSD%值，结果表明该法测定回收率良好。计算结果见表2。

Table 2 Recoveries of polyene phosphatidyl choline表2 多烯磷脂酰胆碱回收率结果

2.2.5.2 溶血磷脂酰胆碱回收率

将多烯磷脂酰胆碱胶囊供试品溶液注入液相色谱仪，测得其中所含溶血磷脂酰胆碱浓度，以此为本底。根据峰面积代入溶血磷脂酰胆碱标曲求得本底中溶血磷脂酰胆碱含量为1.29%。精密称取溶血磷脂酰胆碱适量，加入至本底溶液中，制成低、中、高3个浓度的供试品溶液。各个浓度样品分别各进3针，按含量测定项下的测定方法测定供试品溶液中溶血磷脂酰胆碱的含量，并计算RSD%值，结果表明该法测定回收率良好。计算结果见表3。

Table 3 Recoveries of lyso-phosphatidyl choline表3 溶血磷脂酰胆碱回收率结果

2.2.6 溶液稳定性

将储备液1放置于室温条件下，分别在0 、2 、4 、6 、8 、12 h时间点进样，计算各时间点多烯磷脂酰胆碱及溶血磷脂酰胆碱含量变化,结果如表4所示。结果表明，样品在室温条件下放置不稳定，需临用新制。

Table 4 Stability of the solutions表4 溶液稳定性

2.3 多烯磷脂酰胆碱胶囊含量测定

取磷脂酰胆碱对照品及多烯磷脂酰胆碱胶囊3批，按限度检查测定方法，用各峰面积带入拟合的回归方程计算各批胶囊中多烯磷脂酰胆碱的含量所占胶囊标示量的比值，结果3批（批号:3JD054、3JD069、3JD110）的限度检查（标示量%）分别为97.2%、100.07%、96.9%。

2.4 多烯磷脂酰胆碱有关物质限度检查

2.4.1 溶血磷脂酰胆碱限度检查

取溶血磷脂酰胆碱对照品及多烯磷脂酰胆碱胶囊3批，按限度检查测定方法，用各峰面积带入拟合的回归方程计算各批胶囊中溶血磷脂酰胆碱的含量所占多烯磷脂酰胆碱胶囊标示量的比值，结果3批（批号:3JD054、3JD069、3JD110）的限度检查（标示量%）分别为1.21%、1.26%、1.17%。

2.4.2 磷脂酰乙醇胺限度检查

取磷脂酰乙醇胺对照品及多烯磷脂酰胆碱胶囊3批，按限度检查测定方法，结果本品中磷脂酰乙醇胺未检出。

2.4.3 磷脂酰肌醇限度检查

取磷脂酰肌醇对照品及多烯磷脂酰胆碱胶囊3批，按限度检查测定方法，结果本品中磷脂酰肌醇未检出。

2.4.4 磷脂酸限度检查

取磷脂酸对照品及多烯磷脂酰胆碱胶囊3批，按限度检查测定方法，结果本品中磷脂酸未检出。

3 讨论

由于多烯磷脂酰胆碱紫外吸收波长为205 nm，末端吸收严重，易受辅料、溶剂等干扰，影响检测，且其平均分子量为 800，故选择灵敏度较高的蒸发光散射检测器。蒸发光散射检测器是通用型检测器，可以检测没有紫外吸收的有机物质。

使用蒸发光散射检测器检测样品时，样品浓度跟峰面积不成简单线性，分别取自然对数后方成线性关系。本文中多烯磷脂酰胆碱取自然对数后得到的标准曲线回归方程为 A=1.23c+2.73，相关系数 r=0.999；溶血磷脂酰胆碱取自然对数后得到的标准曲线回归方程为 A=1.13c+2.70，相关系数r=0.999。本文中采用一元二次回归方程进行拟合，回归方程相关系数满足 r2≥0.95，可对多烯磷脂酰胆碱及溶血磷脂酰胆碱进行定量分析，计算准确且简便。由于购买对照品纯度不足，专属性试验单一杂质溶液所得图谱中出现多个色谱峰，根据磷脂酸、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇的相对保留时间依次为0.46、0.88和1.15，获得各物质峰保留时间和出峰位置。

本试验通过不断摸索调节，改变了流动相比例、检测器温度、柱温等条件以获得较高灵敏度、良好峰形和良好分离度。经过方法学验证试验表明该方法系统适用性良好，专属性强，精密度及重现性良好，且具有良好的准确度。

4 结论

采用HPLC-ELSD法可以对多烯磷脂酰胆碱胶囊进行含量测定和有关物质检查。方法准确可靠，灵敏度高，重现性好，操作简便。

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Study on content and related substances of the polyene phosphatidyl choline capsules by HPLC-ELSD

LIU Wan-jun, HUANG Peng, LIU Xiao-hong, XU Lu*
(School of Pharmacy,Shenyang pharmaceutical university, Shenyang110016, China)

ObjectiveTo develop a method for the related substances detection and content determination of polyene phosphatidyl choline capsules.MethodsAn evaporative light-scattering detector combined with normal phase chromatographic system was applied in analysing polyene phosphatidyl choline under gradient elution condition.ResultsA good regression relationship was achieved for polyene phosphatidyl choline in the range of 94～1128 μg·mL-1, and for lyso-phosphatidyl choline in the range of 42～182 μg·mL-1.The average recoveries of polyene phosphatidyl choline and lyso-phosphatidyl choline were 99.13% and 93.79%, respectively. The detection limits of polyene phosphatidyl choline and lyso-phosphatidyl choline were 19 μg·mL-1and 21 μg·mL-1, respectively. Quantification limits of polyene phosphatidyl choline and lyso-phosphatidyl choline were 94 μg·mL-1and 42 μg·mL-1, respectively.ConclusionsThis method can be used in analyzing the related substances of polyene phosphatidyl choline qualitatively and quantitatively.

pharmaceutics; HPLC-ELSD; polyene phosphatidyl choline; content determination

R 94

; A

(本篇责任编辑：时硕坤)

（2015）01-0035-10

10.14146/j.cnki.cjp.2015.01.004

2014-04-16

刘婉君（1989-），女（汉族），河北保定人，硕士研究生，Tel.15040267327, E-mail lwj07106315@ aliyun.com；*

：徐璐（1974-），女（汉族），辽宁沈阳人，副教授，博士，硕士生导师，主要从事物理化学研究。Tel. 024-23986325，E-mail xulu1974@hotmail.com。;