右美托咪定对脂多糖诱导大鼠外周血中性粒细胞TREM－1mRNA表达的影响＊

何绮霞，卢 燕，陈翠平，顾晓霞，庄海霞，张良清（广东医学院附属医院麻醉科，广东湛江524001）

脂多糖（LPS）是革兰阴性细菌细胞壁的主要成分，机体免疫系统会对LPS诱导产生免疫应答，大量细胞因子和炎性介质分泌，从而诱发全身炎性反应，严重者可导致脓毒血症和多器官功能障碍综合征。髓样细胞触发受体－1（triggering receptor expressed on myeloid cells－1，TREM－1）是近年来发现的表达于髓样细胞（如单核／巨噬细胞、中性粒细胞）表面的免疫球蛋白超家族活化受体，它介导的信号传导通路在炎性反应的发生和级联放大中起重要作用［1］，在盲肠结扎穿孔的脓毒症实验动物模型研究发现LPS能引起中性粒细胞和中性粒细胞TREM－1的表达明显增加［2］。右美托咪定是一种高选择性的α2肾上腺素能受体激动剂，可产生镇静、镇痛、抑制交感活动的作用。最近国外多个研究报道地塞米松（DEX）还具有明显的脏器保护及抗炎作用［3－7］。本研究拟探讨右美托咪定对LPS诱导大鼠外周血中性粒细胞TREM－1mRNA表达的影响。

1 材料与方法

1．1 主要试剂和仪器 右美托咪定（江苏恒瑞医药股份有限公司），LPS（Sigma公司，美国），大鼠中性粒细胞分离液（天津灏洋生物制品科技有限公司），台盼蓝检测试剂盒（江苏碧云天生物公司），ELISA试剂盒（大连宝生物工程有限公司），RTPCR相关试剂（Takara公司，日本），引物合成（上海生工生物工程技术服务有限公司），9600型PCR扩增仪（PE公司，美国），DH2000凝胶成像分析系统（中国计量科学研究所）。

1．2 动物选择及外周血中性粒细胞分离 选取健康雄性Wistar大鼠40只，体质量230～270g，由广东医学院实验动物中心提供。用肝素湿润过的注射器穿刺大鼠心脏取血样6 mL，加2mL 6%右旋糖酐生理盐水，混匀后在室温静置30～45min，使红细胞下沉，取上层细胞按1∶1比例叠加到聚蔗糖－泛影葡胺分层液面上，500r／min离心30min；将沉淀细胞用0．83%NH4Cl溶液破坏红细胞，离心洗涤后，悬于2～3mL 0．10%白明胶Hank′s液中，计数并调整细胞浓度，取细胞液涂片，分别作台盼蓝拒染试验和Giemsa染色，鉴定其存活率与纯度。

1．3 实验分组 随机数字表法将细胞随机分为4组（n＝10），A组：阴性对照；B组：中性粒细胞中加入LPS（终浓度为100 μg／L）；C组：中性粒细胞中加入LPS（终浓度为100μg／L）加右美托咪定（终浓度为0．5ng／mL）；D组：中性粒细胞中加入LPS（终浓度为100μg／L）加右美托咪定（终浓度为1．0ng／mL）。

1．4 观察指标 各组细胞孵育24h后，收集培养上清液，－20℃存放，采用 ELISA 法测定 TNF－α、IL－1β和IL－6的浓度。另提取细胞总RNA，RT－PCR法测定TREM－1mRNA表达水平。TREM－1上游引物：5′－ACC ACC ACC ATG GAA CTC CGA GCT GCA ACT AAA T－3′；下 游 引 物：5′－GGG AAC ACA CCT CGA GCC TGA TGA TAT CTG TCA C－3′。扩增片段长度552bp。以β－actin作为内参，β－actin上游引物：5′－ACC ACA GCT GAG AGG AAT CG－3′，下游引物：5′－AGA GGT TTA CGT GTC AAC GC－3′，扩增片段长度 256bp。PCR反应体系25μL，反应条件为：94℃变性5min后，按94℃30s，60℃50s，72℃50s，扩增30个循环，最后72℃延伸10min。取各样本PCR产物4μL和溴酚蓝载样缓冲液1μL，加入1．5%琼脂糖凝聚样品孔中，80V恒压电泳20min，用DH2000凝胶图像分析系统进行分析结果，以TREM－1mRNA条带灰度值与β－actin条带灰度值的比值反映TREM－1mRNA表达水平。

1．5 统计学处理 采用SPSS 16．0统计软件分析处理，计量资料以x±s表示，计数资料采用χ2检验，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

4 组 大 鼠 外 周 血 中 性 粒 细 胞 TNF－α、IL－1β、IL－6 和TREM－1mRNA的比较。与A组比较，B组TREM－1mRNA表达上调，TNF－α、IL－1β和IL－6的浓度升高（P＜0．05）；与 B组比较，C组和 D组 TREM－1mRNA 表达下调，TNF－α、IL－1β和IL－6的浓度降低（P＜0．05）；C组与D组 TREM－1mRNA表达及TNF－α、IL－1β和IL－6的浓度比较差异无统计学意义（P＞0．05），见表1。

表1 4组大鼠外周血中性粒细胞 TNF－α、IL－1β、IL－6和TREM－1mRNA的比较（x±s，n＝10）

3 讨 论

2001年，Bouchon等［8］首次报道了 TREM－1作为介导脓毒性休克的关键介质触发并扩大了炎性反应。TREM－1能够通过跨膜调节蛋白DAP12引起髓样细胞内蛋白激酶磷酸化，触发和放大炎性反应，使中性粒细胞和单核细胞释放IL－1β、IL－2、IL－6、IL－8、IL－12、p40、TNF－α、髓过氧化酶（MPO）、中性粒细胞趋化蛋白－1（MCP－1）、MCP－3、巨噬细胞炎性蛋白－1α（MIP－1α），以及活性氧自由基，触发中性粒细胞和单核细胞的炎症反应，诱导炎症因子的分泌和钙离子的动员，使机体产生炎症因子形成瀑布效应，使炎症扩大甚至失去控制［1，9－10］。陆立仁等［11］前期研究表明，用100μg／L的LPS刺激人中性粒细胞系THP－1细胞表面的TREM－1表达上调。因此，本研究将LPS终浓度定为100μg／L，结果表明，给予LPS刺激后，B组与A组比较，大鼠外周血中性粒细胞TREM－1mRNA表达上调，TNF－α、IL－1β和IL－6的浓度升高，说明LPS可诱导中性粒细胞活化，导致 TREM－1合成增加，从而诱发 TNF－α、IL－1β和IL－6的生成与释放。临床上右美托咪定的推荐治疗靶浓度为0．4～1．2ng／mL。因此，本研究选择C、D组分别加入右美托咪定终浓度为0．5ng／mL和1．0ng／mL，结果表明，与B组比较，C组和 D 组 TREM－1mRNA 表达下调，TNF－α、IL－1β和IL－6的浓度降低，说明右美托咪定可下调TREM－1mRNA表达，抑制TREM－1的合成，抑制LPS诱导大鼠外周血中性粒细胞 TNF－α、IL－1β和IL－6生成与释放。

右美托咪定下调TREM－1mRNA表达的机制目前尚不清楚。 研 究 结 果 显 示［12－13］，在 TLR－4 配 体 存 在 的 条 件 下，TREM－1激活可放大促炎性细胞因子 TNF－α、IL－1β的释放，同时减少抗炎细胞因子IL－10释放，而且激活TLR可使TREM－1表达水平上升，TREM－1表达水平可改变TLR－4信号转导途径关键受体和效应蛋白的表达，从而调节TLR－4途径效应，因而，TREM－1与TLR信号通路可能存在协同作用。闫东来等［14］研究显示，DEX可通过下调 TLR－4mRNA的表达，抑制TLR－4的合成，从而抑制LPS诱导大鼠外周血单核细胞TNF－α、IL－1β和IL－6生成与释放。因此，作者推测右美托咪定下调TREM－1mRNA表达与TLR－4信号转导途径关键受体和效应蛋白的表达有关。

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