Ⅱ型胶原酶消化时间对兔软骨细胞生物学特性的影响＊

袁德超，陈 竹，邓 尚，冯 刚△

（1．泸州医学院，四川泸州646000；2．四川省南充市中心医院／川北医学院第二临床医学院组织工程与干细胞研究所，四川南充637000）

目前，软骨细胞在临床研究和基础实验方面均应用广泛，如软骨类疾病的基础研究［1］、软骨和气管组织工程的构建［2］，缺损关节软骨的修复、美容整形［3］等方面。软骨细胞的分离培养技术已经比较成熟，主要采用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶序贯消化法或单纯Ⅱ型胶原酶消化法，但对于获得软骨细胞最重要的胶原酶消化时间仍具有较大争议，本文旨在探讨获取原代软骨细胞的最佳消化时间，优化软骨细胞体外分离培养技术。

1 材料与方法

1．1 材料 3月龄新西兰大白兔25只（川北医学院实验动物中心提供），雌雄不限，体质量1．5～2．5kg；CO2孵箱采自美国Thermo公司；甲苯胺蓝染液、番红－O染液、Ⅱ型胶原酶购自美国sigma公司；蛋白多糖（aggrecan）一抗（小鼠抗兔）、二抗（山羊抗小鼠）购自美国Thermo公司；Ⅱ型胶原免疫组织化学试剂盒购自美国Chondrex公司；其他试剂均为市售分析纯。

1．2 软骨细胞的消化分离和培养 将新西兰大白兔分为A、B、C、D、E组，每组5只。用1%戊巴比妥钠过量麻醉处死。取肋软骨浸泡于含双抗（1%青霉素和链霉素）PBS中，转入超净工作台，去除软骨周围肌肉和筋膜，用手术刀把软骨块切碎成1mm3（甚至更小）。将软骨块收集入50mL离心管中，加0．2%Ⅱ型胶原酶5mL，37℃恒温摇床中震荡。A、B、C、D、E组分别连续消化4、8、12、16、20h，各组在中位时间点更新1次Ⅱ型胶原酶。消化相应的时间后离心，弃上清液，加入DMEM培养基（含10%FBS，1%双抗）8mL，接种于T75的培养瓶中，置于37℃、体积分数5%CO2培养箱培养。

1．3 检测指标

1．3．1 原代软骨细胞的计数和活性检测 将细胞悬液吸出少许，滴加在盖玻片边缘，使悬液充满盖玻片和计数板之间。镜下计算计数板4大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：每毫升细胞数＝（4大格细胞总数／4）×104。用台盼蓝染液检测细胞活性，吸取90μL细胞悬液到离心管中，加入10μL染液轻轻混匀，染色1min，细胞活性率＝（细胞总数－蓝色细胞数）／细胞总数×100%。

1．3．2 细胞形态观察 （1）原代细胞贴壁情况：原代细胞装瓶48h后光镜下观察细胞贴壁情况。（2）P2代细胞番红－O染色：取各组P1代软骨细胞行细胞爬片，4%多聚甲醛室温固定30min，0．2%快绿染色1min；0．5%番红－O 染色5min，中性树胶封片。（3）P2代细胞甲苯胺蓝染色：取各组P1代软骨细胞行细胞爬片，多聚甲醛室温固定30min，甲苯胺蓝染色4h，中性树胶封片。

1．3．3 细胞免疫组织学染色 （1）P2代细胞蛋白多糖（aggrecan）免疫荧光染色：取各组P1代软骨细胞行细胞爬片，4%多聚甲醛室温固定30min，0．3%Triton－100孵育10min，添加一抗4℃过夜，添加二抗室温下孵育1h，抗荧光淬灭剂封片。（2）P2代细胞Ⅱ型胶原免疫组化染色：取各组P1代软骨细胞行细胞爬片，4%多聚甲醛室温固定30min，2%牛透明质酸酶30min，3%过氧化氢10min，0．3%Triton－100孵育10min；Ⅱ型胶原一抗4℃过夜，添加二抗在室温下孵育1h；DAB显色5～10 min，苏木素复染1min，75%盐酸酒精1s，中性树胶封片。

1．3．4 CCK－8法测定P2代软骨细胞生长增殖曲线 取P1代软骨细胞用含10%FBS的DMEM培养基配成单个细胞悬液，细胞计数1×104个／mL，以每孔体积100μL加入96孔培养板中。每组接种1板，每板接种5列，共接种40板。CCK－8检测液用DMEM培养液按1∶10（体积比）稀释成工作液，分别于培养1、2、3、4、5、6、7、8d，每孔加入200μL工作液，置于细胞培养箱孵化4h，终止培养，酶标仪上450nm处测OD值。

1．4 统计学处理 采用SPSS17．0统计软件进行统计分析，计量资料正态分布用x±s，每组间均数比较采用方差分析，组间两两比较采用SNK－q检验，检验水准α＝0．05，以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

2．1 原代软骨细胞的计数和活性检测 见表1。

表1 原代软骨细胞的计数和活性率

2．2 细胞形态观察

2．2．1 原代细胞贴壁情况 待原代软骨细胞装瓶48h后：A组培养瓶内可见大量组织块，组织块周围见大量未消化出来的软骨细胞，贴壁细胞少；B组培养瓶内见少量组织块，大量胶原纤维缠绕软骨细胞，贴壁细胞较少；C、D组培养瓶内未见组织块和胶原纤维，细胞基本上贴壁；E组培养瓶内未见组织块和胶原纤维，可见大量悬浮未贴壁的细胞，见图1。

图1 各组原代软骨细胞装瓶48h后镜下观察细胞贴壁情况（×100）

2．2．2 P2代软骨细胞的番红－O染色和甲苯胺蓝染色 5组细胞番红染色均呈阳性，细胞形态呈多边形，胞质呈深红色，胞核浅红色，核周可见棕红色颗粒，C、D组细胞染色更深，见图2。5组P2代细胞甲苯胺蓝染色均呈阳性，细胞形态呈多边形，胞质蓝染，核周及胞质内可见异染颗粒，见图3。

图2 各组P2代软骨细胞番红－O染色（×200）

图3 各组P2代软骨细胞甲苯胺蓝染色（×200）

图4 各组P2代软骨细胞蛋白聚糖免疫荧光染色（×200）

图5 各组P2代软骨细胞Ⅱ型胶原免疫组化染色（×200）

2．3 P2代软骨细胞蛋白多糖免疫荧光和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色 5组P2代细胞蛋白多糖免疫荧光染色均呈阳性，镜下可见胞质发绿色荧光，胞核不发荧光，C、D组细胞胞质绿色荧光最强，见图4。5组P2代细胞Ⅱ型胶原免疫组织化学染色均显示阳性，部分细胞胞质着黄褐色，胞核为苏木素淡染的蓝色，核周可见颗粒状物质沉着，C、D组阳性细胞较其余3组的多，见图5。

2．4 P2代软骨细胞生长增殖曲线 培养第1～2天为潜伏期，第2～6天为指数增生期，以后进入平台期，见图6。培养第3～8天时，C、D组与其余3组的OD值差异有统计学意义（P＜0．01）；培养第1～8天时，C、D组间OD 值差异无统计学意义（P＞0．05）。

图6 各组P2代软骨细胞生长增殖曲线

3 讨 论

软骨细胞被广泛应用于骨关节炎退变机制的研究［1］、构建软骨组织工程［4］、软骨组织的修复［5］。软骨细胞的获取主要是通过切取自身软骨组织，经酶消化体外培养获得的。目前，软骨细胞的分离培养技术已比较成熟，主要采用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶序贯消化法或单纯Ⅱ型胶原酶消化法。无论哪种方法，均需要用到Ⅱ型胶原酶，因为软骨组织中的细胞外基质主要为胶原纤维蛋白和蛋白多糖，其中胶原占软骨总质量的50%～70%，Ⅱ型胶原占所有胶原的90%以上，蛋白多糖占软骨总质量的20%～40%［6］。所以要获得游离的软骨细胞，必须充分消化分解软骨组织中的Ⅱ型胶原。

总的来说随着Ⅱ型胶原酶消化时间的延长，获得的游离的软骨细胞越多，活性率越低。过长的消化时间将破坏软骨细胞的细胞活性，从而影响细胞的生长和细胞外基质的分泌。因此，合理的消化时间是获得具有良好细胞活性的软骨细胞的一个重要参数。根据文献报道，Ⅱ型胶原酶的浓度一般是0．1%～0．3%［7－8］，但关于消化时间的报道却具有较大的差异。Little等［9］将0．2%Ⅱ型胶原酶在37℃恒温水浴条件下消化软骨组织4h获取软骨细胞，Heywood等［10］用0．2%Ⅱ型胶原酶消化软骨组织12h获得软骨细胞；Ingavle等［11］将软骨组织用0．2% Ⅱ型胶原酶消化18～20h亦能获取大量活性良好的软骨细胞。

针对该问题，本实验采用单纯Ⅱ型胶原酶消化法分离软骨细胞，通过固定胶原酶浓度为0．2%，改变消化时间，比较不同消化时间获得的软骨细胞的生物学特性，探讨Ⅱ型胶原酶的最佳消化时间。本实验对软骨细胞生物学特性的鉴定主要从细胞形态和分泌功能方面来判断，表型良好的软骨细胞在形态上为多边形，在功能上为分泌蛋白多糖和Ⅱ型胶原。蛋白多糖和Ⅱ型胶原是鉴别软骨细胞的特异性标志物，其减少或丧失标志着软骨细胞的去分化，软骨细胞在P2代之前能维持正常细胞表型［12］，故通过对P2代细胞行番红－O染色、甲苯胺蓝染色、蛋白多糖免疫荧光和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察细胞形态和分泌功能。

实验发现，C、D组连续消化12～16h获得的细胞量多，细胞活性率较高，原代细胞贴壁良好，P2代细胞能保持软骨细胞生物学特性，增殖能力强。消化时间不足会使组织块消化不全，大量的软骨细胞得不到分离。如实验中A、B组，接种的原代细胞贴壁24h后，镜下可见大量未分离的细胞，消化不全的胶原纤维缠绕软骨细胞，阻碍细胞贴壁。延长消化时间可将胶原纤维充分消化，但同时会对细胞膜造成伤害，细胞活性率降低。实验中E组有较多原代细胞不能贴壁，消化时间过长，细胞活性率降低；C、D组中原代细胞贴壁良好，消化时间适当，细胞活性率较高。

5组体外培养后的P2代细胞在形态和功能方面均能维持软骨细胞表型，相比较而言，C、D组细胞表型最好，E组其次，A、B组最差，这与原代细胞接种密度有关。软骨细胞在体外培养时，随着传代次数的增加极易发生去分化表现，特别是在低细胞密度培养时；软骨细胞在一定范围的高密度培养有利于维持细胞表型，细胞之间相互促进生长增殖［13］。C、D组P2代细胞形态和分泌功能均良好，在番红－O染色、甲苯胺蓝染色、蛋白聚糖免疫荧光染色、细胞生长增殖速度方面均优于其他3组，Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性数多于其余3组。说明以C、D组的高细胞密度接种原代细胞更有利于维持细胞表型，这与文献报道相符。E组细胞由于Ⅱ型胶原酶消化时间太长，虽然细胞数量多，但是细胞活性低，原代细胞贴壁少；A、B组Ⅱ型胶原酶消化时间不足，大量软骨细胞未得到分离，原代细胞贴壁少，都不利于细胞表型的维持和细胞生长增殖。可见通过适当延长Ⅱ型胶原酶消化时间，提高软骨细胞接种密度是维持细胞表型和活性的良好方法。

在兔肋软骨细胞分离培养中，Ⅱ型胶原酶最佳消化时间为12～16h，能获得大量活性率较高、贴壁良好、增殖能力强的软骨细胞，P2代软骨细胞表型稳定。探索Ⅱ型胶原酶的最佳消化时间，有助于获取大量活性良好的原代软骨细胞，为基础实验和临床研究提供大量优质的软骨细胞。

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