腹腔镜与开腹建立犬胆道梗阻模型的对比研究*

薛 飞 吕 毅 虢宏昌 马 锋 严小鹏 李建鹏 徐向华 陆建文 董鼎辉 朱皓阳 白纪刚 李建辉 刘亚雄

(西安交通大学第一附属医院肝胆外科，西安 710061)



·实验研究·

腹腔镜与开腹建立犬胆道梗阻模型的对比研究*

薛 飞 吕 毅**虢宏昌①马 锋 严小鹏 李建鹏 徐向华 陆建文 董鼎辉 朱皓阳 白纪刚 李建辉 刘亚雄①

(西安交通大学第一附属医院肝胆外科，西安 710061)

目的 探讨腹腔镜建造犬胆道梗阻模型的可行性及其与开腹方式相比的优越性。 方法 将16只本地健康杂种犬随机分为2组，每组8只，分别行腹腔镜或开腹胆总管结扎术，比较2组手术时间、术后并发症、术后麻醉复苏、术后胃肠道恢复情况，以及术前、术后不同时间点白细胞、C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)及血清降钙素原(procalcitonin，PCT)水平，术后10天进行大体观粘连Nair分级并取组织行病理学观察。 结果 与开腹组相比，腹腔镜组手术时间短[(39.6±3.1)min vs. (69.4±8.6)min，t=-9.183，P=0.001]，麻醉苏醒早[(58.8±10.9)min vs. (92.4±13.9)min，t=-5.380，P=0.001]，术后首次自主进食早[(3.6±0.6)h vs. (6.8±1.1)h，t=-7.439，P=0.001]，首次排便早[(1.0±0.0)d vs. (1.9±0.6)d，t=-3.862，P=0.006]，各时点白细胞、CRP、粘连指数Nair评分、结扎部位胆道组织病理学分级，腹腔镜组均优于开腹组且具有统计学意义(P<0.05)，各时间点PCT、肝功能、胆红素水平2组差异无显著性(P>0.05)。 结论 腹腔镜建造犬胆道梗阻模型是一种微创、简便的方式，炎症水平及腹腔粘连程度较低，有利于二次手术和进一步实验研究。

腹腔镜； 开腹手术； 胆道梗阻； 动物模型

胆道疾病是临床常见病及多发病，同样也是研究的热点疾病，通过建立动物模型进行胆道疾病研究显得尤为重要。通常所用的建造胆道梗阻模型的方式主要包括胆总管结扎法和胆道钳夹法[1]，但均需开腹进行，费时费力的同时，也增加了手术的创伤度及风险性，诸多干扰因素也容易导致实验数据偏倚。本研究团队探讨利用腹腔镜微创技术完成模型建立，简化操作方式，降低创伤及术后粘连程度。为进一步印证腹腔镜造模方式的优势所在，本研究针对腹腔镜与开腹两种造模方式进行比较，现将相关结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

本地杂种犬16只，体重10～15 kg，雌雄不限，由西安交通大学医学院动物实验中心提供(SYXK陕2014-003)。本实验过程及对动物的处置符合动物伦理学标准，实验方案获得西安交通大学动物伦理委员会批准(No.XJTULAC201-395)。将实验犬随机分为2组，每组8只，分别进行腹腔镜或开腹胆道结扎术。

1.2 实验方法

手术器械及耗材均经过高温高压灭菌处理，腹腔镜设备及器械均购置于Karl Storz GmbH & Co. KG公司。实验动物术前常规禁食12 h、禁水6 h。腹腔注射3%戊巴比妥钠(1 mg/kg)全身麻醉。麻醉起效后，腹部剃毛，仰卧位固定，消毒，铺无菌手术单。

1.2.1 开腹组 上腹正中切口入腹，长约10 cm。生理盐水纱布覆盖胃十二指肠，向下腹部牵拉，充分暴露肝门部结构。仔细分离，显露胆总管长约1 cm，直径1～2 mm，近十二指肠缘处用4-0不可吸收丝线结扎。检查无出血、胆漏后关腹，术后给予抗炎补液对症处理。

1.2.2 腹腔镜组 采用三孔法。2把巾钳提起脐上缘腹壁皮肤，切开皮肤、皮下层长约1 cm，垂直穿刺置入气腹针，检查确定气腹针在腹腔内后，接通CO2气腹机。开始充气时，速度不宜太快，以1 L/min为宜。严密观察犬的呼吸和心率，维持气腹压力10 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)。于穿刺部位置入10 mm trocar和腹腔镜，左锁中线肋缘下2 cm置入10 mm trocar，右锁中线肋缘下2 cm置入5 mm trocar。抓钳钳夹生理盐水纱布撑起肝脏，充分显露肝门部，电钩结合分离钳钝性分离肝十二指肠韧带，于十二指肠上缘处分离胆总管长约5 mm，直径1～2 mm。近十二指肠上缘处以4-0不可吸收丝线结扎。检查腹腔内无活动性出血后关闭各穿刺孔，术后严密观察。

1.3 观察指标

1.3.1 手术时间 记录从切皮至缝皮结束所用的时间。

1.3.2 外周血检测 术前1 d、术后3 d、术后7 d以及术后10 d分别从大隐静脉采集静脉血，行血常规、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、直接胆红素、间接胆红素、总胆红素、C反应蛋白(CRP)及血清降钙素原(PCT)测定。

1.3.3 术后恢复情况 记录术后麻醉清醒时间(动物意识恢复表现为睁眼及四肢少量活动)、术后首次自主进食水时间及术后首次排粪便时间。密切观察手术相关并发症，包括切口渗血、感染、裂开，切口疝，死亡等。

1.3.4 大体观察 术后10 d，2组均再次开腹，观察腹腔内粘连情况。根据Nair五级分级标准[2,3]对腹腔粘连程度进行分级：0级，完全无粘连；Ⅰ级，单个纤细粘连；Ⅱ级，单个或2个轻度粘连，粘连带宽<1 cm；Ⅲ级，重度粘连，2个以上粘连或1个粘连带宽>1 cm；Ⅳ级，广泛或切口下粘连。

1.3.5 组织学观察 取小块结扎处的胆总管组织(16只实验动物继续行胆肠吻合实验研究，另外报道)，以10%甲醛固定，石蜡包埋、切片，行常规HE染色及Masson染色，显微镜下观察切片并分级[4]。HE染色按浆膜侧纤维结缔组织增生及胶原化的程度分级[5]：Ⅰ级，少量纤维组织增生(<10%)；Ⅱ级，中等量纤维组织增生(10%～50%)；Ⅲ级，大量纤维组织增生(>50%)。Masson染色以粘连部位总胶原含量情况进行分级(胶原组织显蓝色，分级判定结果在高年资病理诊断医生指导下完成)：Ⅰ级，粘连组织呈浅蓝色；Ⅱ级，粘连组织呈蓝色；Ⅲ级，粘连组织呈深蓝色。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 手术时间及术后恢复情况(表1)

与开腹组相比，腹腔镜组手术时间短，麻醉清醒早，术后首次自主进食和排便早。腹腔镜组无术后并发症发生，开腹组切口感染4例，切口裂开1例，无出血、死亡等发生。

*Fisher’s Exact Test

2.2 外周血检查结果(表2)

2组术后白细胞水平均明显升高，腹腔镜组升高幅度明显小于开腹组，且于术后7日降至正常，优于开腹组；CRP水平腹腔镜组无变化，始终小于最低检出水平，而开腹组术后明显升高；手术前后PCT水平2组改变不大；各肝酶水平以及胆红素变化差异均无统计学意义(P>0.05)。

表2 2组不同时间点各项血液检查结果比较(n=8)

2.3 大体和组织学观察(表3)

术后10 d，腹腔镜组普遍粘连较少，各组织结构游离度良好，开腹组粘连带较多且宽，不易于分离(图1)，根据Nair五级分级标准，2组间差异有统计学意义(P=0.003)。

结扎部位组织HE染色可见腹腔镜组组织黏膜、浆膜层完整连续，腺体较丰富、排布规整，散在少量炎性细胞浸润，浆膜外少量纤维结缔组织增生；开腹组可见浆膜层连续性不完整，炎症细胞浸润较多，浆膜外大量纤维结缔组织增生(图2)。根据组织浆膜侧纤维结缔组织增生及胶原化的程度分级，开腹组较腹腔镜组严重(P=0.043)。

Masson染色镜下可见腹腔镜组浆膜层外少量胶原组织成分，染色呈浅蓝色，根据总胶原含量进行分级多为Ⅰ级，开腹组浆膜层外胶原组织较多，染色呈深蓝(图3)，分级多为Ⅲ级，2组比较具有统计学差异(P=0.009)。

表3 2组术后大体和组织学分级(n=8)

图1 术后10 d结扎部位大体观，腹腔镜组粘连Ⅰ级(A)，开腹组Ⅲ级(B) 图2 结扎部位HE染色(×100)，腹腔镜组HE分级Ⅰ级(A)，开腹组Ⅲ级(B) 图3 结扎部位Masson染色(×100)，腹腔镜组Masson分级Ⅱ级(A)，开腹组Ⅲ级(B)

3 讨论

通过建立动物疾病模型来研究疾病机制的方法已经很成熟，也是越来越被广大科研人员所认可的方法之一。疾病的动物模型主要可以分为自发模型、手术模型、化学诱导模型和当前国际生物医学研究火热的基因组改造模型[6]。利用动物模型来研究的胆道疾病也有很多，如胆管炎、胆结石、胆道梗阻等。动物模型基本上都是开腹手术完成，手术创伤大、风险性高、术后粘连重等因素严重影响下一步实验研究的进行。探索一种新型的建模技术，在保证模型建立成功的前提下，尽可能降低手术创伤所带来的影响，成为目前手术动物建模中有待解决的问题。

腹腔镜技术作为当今世界医学发展的重要标志之一，其微创、恢复快等优点得到了人们的充分认识与肯定，并在短短的几十年内应用于医学的多个领域[7]。国内外动物医学领域也有部分应用腹腔镜进行简单的动物手术的报道，例如：Pukacz等[8]在腹腔镜下完成犬子宫卵巢切除术，并证明其方法的可行性，Runge等[9]用腹腔镜进行动物隐睾切除术，时鑫等[10]运用腔镜技术完成了动物腹腔多脏器手术教学。基于腹腔镜动物外科手术的先例，加之本研究团队长期以来在微创外科手术方面的探索，我们探讨通过腹腔镜技术来完成犬胆道梗阻模型的建立，并与开腹胆道结扎组进行对比实验，结果显示：腹腔镜组较短的手术时间及麻醉时间大大缩短了动物术后复苏过程，动物清醒较早，进食时间较快导致术后恢复情况与开腹组相比具有明显优势，大大降低了动物术后并发症的发生。对白细胞、C反应蛋白定期检测结果显示，腹腔镜组相比于开腹组创伤较轻、炎症反应小且炎症下降快，充分证明了腹腔镜组微创化的操作方式更利于胆道梗阻动物模型的建立。

腹部手术后腹腔粘连是最常见的并发症之一，尤其在开腹手术之后，其发生率为63%～97%[11～13]。近几年的研究表明，术后腹腔粘连与手术创伤、局部炎症反应及富含纤维素的渗出等因素有关，纤维素交织成网，在损伤处形成桥式连接以利于浆膜修复[14]。在这过程中，结缔组织生长因子(CTGF)等多种因子的共同作用促进了术后腹腔纤维素及新生血管的生成，最终形成永久性的脏器粘连[15]。腹腔镜具有创伤小、炎症轻的优势，术后腹腔内粘连较轻；国内外临床实例或动物实验亦有报道，腹腔镜手术能有效避免空气以及术者对脏器的直接接触，大大降低术后脏器粘连程度[16～18]。我们通过腹腔镜技术实现胆道结扎动物模型构建，相比于开腹组降低了炎症反应及感染程度，减少了因炎症反应刺激导致的纤维蛋白渗出及纤维性粘连，胶原的沉积。并通过Nair五级粘连评分以及HE、Masson染色得以证实，腹腔镜组术后粘连程度较轻。

总体来说，腹腔镜建造动物模型具有以下几点优势：①腹腔镜建模方便、简易、手术时间短，较短的手术时间便于动物麻醉复苏，大大降低了麻醉所带来的手术风险；②腹腔镜建模创伤小、炎症轻、术后并发症少、胃肠功能恢复快无须限制术后进食，便于机体功能恢复；③腹腔镜建模术后腹腔粘连轻，尤其适用于需二次开腹手术的动物疾病模型，如消化道穿孔动物模型、脏器出血动物模型、梗阻模型及腹膜炎动物模型等。本实验拟通过建造犬胆道梗阻模型进一步行胆肠吻合实验研究，密集的两次手术不仅增大了动物死亡的风险，而且严重的腹腔粘连大大增加了二次手术的难度，因此腹腔镜建模无疑是最好的建模选择。腹腔镜动物建模方式仍有许多局限，腹腔镜器械较昂贵，无法满足普通动物外科实验室的需求；同时，腹腔镜手术仅限于猪、狗、羊等大动物手术操作，但开展大动物手术的实验室甚少，大部分仍以老鼠、兔子等小动物为主；腔镜操作难度相对较高、学习曲线长也限制了其广泛应用。但我们仍充满信心，相信这种方式能给更多的动物模型建造带来启示，更多的微创、简便的造模方式有待我们进一步探索与发现。

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3 凌立君,曾 莉,林 娜,等.术后病理性腹腔粘连小鼠模型粘连评价方法的实验研究.中国全科医学,2004,7(23):1742-1744.

4 张立俭,黄振俊,白慧颖,等.电针足三里干预大鼠腹腔粘连的实验研究.中医学报,2011,26(12):1466-1468.

5 Diken Allahverdi T,Allahverdi E,Yayla S,et al.Effects of alpha lipoic acid on intra-abdominal adhesion:an experimental study in a rat model.Ulus Travma Acil Cerrahi Derg,2015,21(1):9-14.

6 江虎军,冯 锋,董尔丹.模式动物与人类疾病的动物模型.生命科学,2011,23(3):234-238.

7 许 军,翟 博.浅谈精准微创外科时代的理性思维.中国微创外科杂志,2012,12(11):984-986.

8 Pukacz M,Kienzle B,Braun J.Simple,minimally invasive technique for ovariohysterectomy in the dog.Vet Rec,2009,165(23): 688-690.

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18 王永军,段 华.腹腔粘连与腹腔镜手术治疗粘连的研究现状.中国微创外科杂志,2005,5(3):214-215.

(修回日期：2015-03-27)

(责任编辑：王惠群)

A Comparative Study Between Laparoscopy and Laparotomy in Establishing Biliary Obstruction Model in Dogs

XueFei*,LüYi*,GuoHongchang,etal.

*DepartmentofHepatobiliarySurgery,FirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710061,China

Correspondingauthor:LüYi,E-mail:luyi169@126.com

Objective To explore the feasibility of using laparoscopic technique to create animal model of biliary occlusion and its advantages as compared to laparotomy. Methods Sixteen local mongrel dogs were randomly divided into two groups with 8 dogs in each group. One group was given laparoscopic common bile duct ligation and the other group underwent laparotomy. The operation time, postoperative complications, anesthesia recovery time, gastrointestinal tract recovery condition, and the leucocyte, C-reactive protein (CRP) and procalcitonin (PCT) before and after operations were tested in different time points between the two groups. The histological features of ligation parts and the level of intraperitoneal adhesion (Nair score) were examined 10 days after operation. Results As compared to the laparotomy group, the laparoscopy group had significant shorter operation time [(39.6±3.1) min vs. (69.4±8.6) min,t=-9.183,P=0.001], shorter anesthesia recovery time [(58.8±10.9) min vs. (92.4±13.9) min,t=-5.380,P=0.001], earlier first eating time [(3.6±0.6) h vs. (6.8±1.1) h,t=-7.439,P=0.001], and earlier first defecation time [(1.0±0.0) d vs. (1.9±0.6) d,t=-3.862,P=0.006]. The leucocyte counts and CRP levels of different time points, adhesion index (Nair score), and histological grading of ligated bile duct in the laparoscopy group were superior to those in the laparotomy group (P<0.05). There were no significant differences in liver functions, serum PCT, and bilirubin value at different time points between the two groups (P>0.05). Conclusions Laparoscopic biliary occlusion is a simple and minimal invasive way to establish animal models. The technique is helpful to second operation and further study because of its lower inflammation rate and abdominal adhesion extent.

Laparoscopy; Laparotomy; Biliary obstruction; Animal model

国家自然科学基金科学仪器专项(81127005)；国家自然科学基金资助项目(51275387)

R-332

A

1009-6604(2015)08-0729-05

10.3969/j.issn.1009-6604.2015.08.018

2014-11-28)

**通讯作者，E-mail：luyi169@126.com

① (西安交通大学机械制造系统工程国家重点实验室，西安 710049)