亚硒酸钠哺乳动物细胞染色体畸变试验研究

李元新，刘来利，王必成，张鹏岳

（甘肃省畜牧兽医研究所，甘肃 平凉744000）

硒是人体和动物所必需的的微量元素，可用于癌症的化学预防，并且具有抗氧化和抗突变的作用，但较高浓度的硒亦有一定毒性。目前硒的遗传毒性报告较少。为了探讨亚硒酸钠的安全性，通过亚硒酸钠哺乳动物细胞染色体畸变试验对其的致突变性进行了评价。

1 材料

1.1 受试物及其对照品

试验时配制方法：称取亚硒酸钠0.04202g，用灭菌纯化水溶解，配制成4.20μg／mL（IC50），2.10 μg／mL（1／2IC50）和1.050μg／mL（1／4IC50）浓度。注射用丝裂霉素（浙江海正药业股份有限公司），批号：111117，试验时配成12.5g／mL 溶液。注射用环磷酰胺（江苏恒瑞医药股份有限公司）批号：12042425，试验时配制成1mg／mL的溶液。

1.2 主要试剂

胰蛋白酶（Sigma，批号：0458）；乙二胺四乙酸二钾（成都市科龙化工试剂厂，批号：20110127）；MEM 培养液（成都哈里生物工程有限公司，批号20120805）；新生牛血清（成都哈里生物工程有限公司，批号：120510）；注射用青霉素钠（80 万单位，华北制药股份有限公司，批号：S1107304）；注射用硫酸链霉素（100万单位，华北制药股份有限公司。批号：1111106）；葡萄糖－6－磷酸二钠（Sigma生产，批号：G－7250）；NADP（Sigma，批号：004669），苯酚红（成都市科龙化工试剂厂，批号：20120501）；秋水仙素（上海蓝剂科技发展有限公司。批号：051212）；姬 姆 萨 染 料（Sigma 生 产，批 号：G－4507），其余试剂均为国产分析纯。

1.3 主要仪器

YXQ.SG41.280手提式压力蒸汽消毒器（上海华线医用核子仪器有限公司）；XDS－1B 倒置显微镜（重庆麦克光电仪器有限公司）；311二氧化碳培养箱，美国THERMO FORMA 公司）；NT 系列净化工作台（吴江市金乐净化设备厂）；水浴锅（上海宝磊仪器有限公司，型号：HH－S24S）；0406－1台式低速离心机（上海医疗器械（集团）有限公司手术器械厂）；XB－K－25血球计数板（玉环县求精医用仪器厂）；YDS－35－80液氮罐（四川亚西橡塑机器有限公司），XSZ－7G 双目生物显微镜（重庆光电仪器有限公司）；BS124S电子天平（德国Sartorius股份有限公司出品）；AUW120D 型电子天平（日本岛津公司出品）。

1.4 细胞株

选用中国仓鼠肺成纤维细胞（CHL 细胞）对供试品进行检测，购自中科院昆明细胞库，需定期检查是否有支原体等污染，液氮保存，按常规要求复苏、接种和传代细胞。

2 试验方法

2.1 体外哺乳动物细胞（CHL）染色体畸变试验

根据《根据遗传毒性研究技术指导原则》，3个亚硒酸钠浓度组，分别为4.20g／mL（IC50），2.10g／mL（1／2IC50）和1.05g／mL（1／4IC50）。并同时设置阴性对照组为纯化水，阳性对照组在未加S9mix用丝裂霉素（22h的浓度为0.25g／mL，接触6h的浓度为0.5g／mL），加S9mix用环磷酰胺（终浓度为20 g／mL）。以上5组受试物均用灭菌纯化水配制。将生长旺盛的CHL 细胞用胰蛋白酶液消化，用含10%的新生牛血清MEM 细胞培养液制备成（1～2）×104个／mL的细胞悬液，按每瓶（25cm2规格）接种5mL，每组3个平行，置于37 ℃，5%CO2培养箱培养24h，弃去细胞培养液，加入4.5mL含不同浓度受试物溶液或阴性、阳性对照液，需活化时每年瓶加S9混合液0.5 mL，不需要活化时每年瓶加0.5 mLMEM 培养 液，继 续 置37 ℃、5%CO2培 养 箱 培养6h，用PBS洗涤3次，各组再加入5.0mLMEM培养液，37 ℃、5%CO2培养箱再培养16h，与作用22h的细胞同时收获。收获细胞前2h，加入秋水仙素使细胞分裂停止于中期分裂相，按常规方法制片、染色。每份标本观察200个中期分裂相细胞，用油镜计染色体畸变数目并记录畸变类型。

2.2 数据统计处理方法

本试验数据为计量资料，采用Excel软件计算平均数、标准差，判断数据是否呈正态分布，正态分布则采用Excel中F 检验进行方差齐性检验，然后选择t检验进行统计；若呈非正态分布，则进行非参数检验。

3 结果及分析

3.1 试验结果

表1 亚硒酸钠对体外哺乳动物细胞染色体畸变试验结果

表1结果显示，亚硒酸钠在加S9混合物（活化条件）和不加S9混合物（非活化条件）时，高剂量组和中剂量组的畸变率与溶媒对照组比较有显著差异性（P＜0.01），畸变率均高于5%且畸变率高低与供试品浓度有依赖性，为阳性结果；低剂量组的畸变率与溶媒对照组比较，差异均无统计学意义（P ＞0.05），畸变率均低于5%，为阴性结果。

3 讨论

染色体畸变是环境有害因素作用于机体或培养的细胞后所致最常见的遗传物质损伤之一，反映的遗传学终点是染色体分离改变和染色体完整性改变。目前，在实验研究中，多用各种细胞系（株）进行实验观察与分析染色体的改变，其中中国仓鼠肺细胞（CHL）是常用的细胞株之一，它能在体外稳定传代细胞株，自发突变率低，对许多化学物的作用敏感，染色体数目正常非突变型为25条，由于染色体数目少，便于分析，被广泛用于染色体畸变试验的研究。

亚硒酸钠在1.05～4.20μg／mL 的剂量下，在加或不加代谢活化剂条件下与CHL 细胞作用，4.20μg／mL，2.10μg／mL剂量可诱发CHL细胞染色体畸变率增高，提示在本实验条件下具有致突变性，1.05μg／mL剂量没有诱发CHL 细胞染色体畸变率增高和染色体损伤的能力。

［1］ 药物遗传毒性研究技术指导原则（第二稿）［S］.2006.

［2］ 袁伯俊，廖阳明，李波.药物毒理学实验方法与技术［M］.北京：化学工业出版社，2007，268－271.

［3］ 袁伯俊，王治乔.新药临床前安全性评价与实践［M］.北京：军事医学科学出版社，1997，78－107.

［4］ 方治平，肖逸，宋晓红，等.重组葡激酶的致突变试验［J］.四川生理科学杂志2000，22（1）：22－26.

［5］ 孙瑞元，郑青山.数学药理学新论［M］.北京：人民卫生出版社，2004：39－48.

［6］ 周立国.药物毒理学［M］.北京：中国医药科技出版社.2003：219－234.

［7］ 张均田.现代药理试验方法［M］.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社.1998：1864－1876.

［8］ 王钦茂，李莉，方华武，等.中药致癌、致突变和生殖毒性研究概况［J］.安徽中医学院学报.2001，20（5）：64－67.