自噬相关基因在乳腺癌ET方案新辅助化疗疗效预测中的作用＊

李 俊，刘晓渝，江歌丽，何笑冬，曹 勇，周 鑫，曾晓华

（重庆市肿瘤研究所乳腺中心 400030）

新辅助化疗目前是治疗局部进展期乳腺癌的标准方案之一，可缩小肿瘤，便于手术，并可根据化疗后临床和病理上的反应判断预后，为进一步选择合适的治疗方法提供依据[1]。然而新辅助化疗如果无效则可能延误手术治疗时机，因此，寻找合适的指标评价新辅助化疗的疗效，对于早期改变治疗方案，及时控制病情发展尤为重要。其中ET方案（表柔比星＋多西紫杉醇）作为乳腺癌新辅助化疗的标准化疗方案之一，目前仍缺乏有效的疗效评价指标以指导进一步治疗方案的选择。研究发现自噬相关基因Atg3与Beclin1的表达与肝癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤的预后密切相关，是重要的预后评价指标之一[2-5]。本研究检测经ET方案行新辅助化疗前乳腺癌组织中Atg3与Beclin1的表达，分析其与化疗后疗效间的差异，评价Atg3与Beclin1在乳腺癌ET方案新辅助化疗疗效预测中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集重庆市肿瘤研究所乳腺科2011年6月至2013年1月收治的41例经粗针穿刺活检证实，以及通过腹部彩超、胸片和骨扫描排除远处转移的临床Ⅲ期女性乳腺癌患者的组织标本。所有患者均有临床可测量的病灶、无其他恶性肿瘤病史、入组前均未接受任何抗癌治疗、一般情况良好，卡氏（Karnofsky）评分为80分以上；血常规、肝肾功能、心肌酶谱和肌钙蛋白正常，心电图正常，心脏射血分数大于55%。

1.2 方法

1.2.1 主要材料与试剂 蛋白裂解液M-PER购自美国Thermo Pierce公司。Atg3和Beclin1一抗购自美国Abcam公司，甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）一抗及相应的二抗和链霉亲和素-生物素复合物（SABC）免疫组织化学试剂盒及DAB显色剂均购自武汉博士德生物工程有限公司。RNA抽提试剂盒购自美国Invitrogen公司，逆转录试剂盒购自美国Bio-Rad公司，实时定量试剂盒购自日本TaKaRaBio株式会社。Atg3、Beclin2与β-actin RNA引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.2 治疗方法 所有患者均签署知情同意书，接受4周期ET方案新辅助化疗：多西紫杉醇75mg／m2，第1天持续3h静脉滴注；表柔比星90mg／m2，第2天静脉滴注。化疗方案每3周重复1次，4周期后评价疗效，后续治疗方案均按照中国抗癌协会乳腺癌诊治指南与规范（2013版）进行[6]。

1.2.3 实时荧光定量PCR测量 将收集的组织标本洗涤、剪碎、研磨，以冷PBS漂洗2次后，加入1mL Trizol，按照Trizol一步法提取组织总RNA，以酶标仪测定RNA纯度和含量。按照逆转录试剂盒说明书操作合成cDNA，实时荧光定量PCR反应按照试剂盒说明书操作。Atg3引物序列为：上游序列5′-GGA AGA AGA TGA AGA TGA A-3′，序列长度19bp；下游序列3′-CAT AAT CGT GGA GTC TGG TA-5′[2]，序列长度20bp。Beclin1引物序列为：上游序列5′-CCT CCT GTG TCT TCA ATC TT-3′，序列长度20bp；下游序列3′-GCT GCC GTT ATA CTG TTC T-5′，序列长度19bp。β-actin引物序列为：上游序列5′-GGA GAT TAC TGC CCT GGC TCC TA-3′，序列长度23bp；下游序列3′-GAC TCA TCG TAC TCC TGC TTG CTG-5′，序列长度24bp。以SYBR GreenⅠ法进行实时荧光定量PCR反应，每样本重复3次，2-△△Ct法进行信使RNA（mRNA）水平相对定量。

1.2.4 蛋白质印迹法（Western blot）测量 将收集的组织标本洗涤、剪碎、研磨后加入蛋白裂解液提取总蛋白。蛋白定量后，煮沸变性后按30μg／孔上样，经12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）后转移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜），以5%脱脂奶粉封闭60min，分别加入Atg3（1∶500）和Beclin1（1∶500）及GAPDH（1∶1 000）一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育1h后，ECL化学发光，以Bio-Rad荧光成像系统显影。目的蛋白表达以GAPDH作为参照相对定量。

1.2.5 免疫组织化学染色及结果判断 以SABC法进行上述组织标本免疫组织化学染色。组织石蜡切片常规脱蜡至水后，以3%过氧化氢浸泡60min以灭活内源性过氧化物酶，洗涤后切片浸入0.01mol／L枸橼酸缓冲液中加热至95℃20min行热修复抗原。自然冷却后以5%牛血清清蛋白封闭切片标本60min，加入Atg3一抗（1∶200）和Beclin1一抗（1∶200），4℃湿盒内孵育过夜。再滴加生物素化二抗室温孵育20min后加入SABC反应液室温孵育20min，最后以DAB显色剂显色，脱水，透明，封片，显微镜观察。Atg3和Beclin1阳性时为乳腺癌细胞的细胞质呈黄色-棕褐色颗粒，采用染色强度与阳性细胞的百分率相结合的判定标准。染色强度：不着色为0分，淡黄色1分，棕黄色2分，黄褐色3分。阳性细胞所占百分比：阳性细胞数小于5%计为0分，5%～＜30%计为1分，30%～＜60%计为2分，≥60%计为3分。两者乘积为染色总分，阴性（-）：0分，弱阳性（＋）：1～4分，中度阳性（＋＋）：5～8分，强阳性（＋＋＋）：9～12分[7]。

1.2.6 化疗疗效评价 化疗前、化疗2周期，以及化疗4周期后均分别采用乳腺磁共振成像（MRI）评估乳腺病灶，根据实体瘤疗效反应评价标准（RECIST）进行疗效评价[8]，分为完全缓解（CR）、部分缓解（PR）、稳定（SD）、疾病进展（PD）和疾病稳定（NC），CR＋PR率为总有效率，手术标本中原发病灶和淋巴结均无肿瘤病灶残留或仅有导管原位癌残留则判定为病理完全缓解（PCR）。26例患者达CR或PR，15例患者为NC或PD。

1.3 统计学处理 应用SPSS11.0统计软件对数据进行统计学处理，计数资料用率表示，组间比较用Fisher确切概率法检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同疗效乳腺癌组织化疗前Atg3与Beclin1mRNA的表达 在26例化疗后有效达CR或PR的患者中，有23例患者化疗前乳腺癌组织中Atg3与Beclin1mRNA高表达，仅3例呈明显低表达或不表达；在15例化疗无效为NC或PD的患者中，有14例患者化疗前乳腺癌组织Atg3与Beclin1mRNA低表达或不表达，仅1例高表达，见图1。

图1 不同疗效患者化疗前乳腺癌组织中Atg3与Beclin1mRNA表达相对比例

2.2 不同疗效乳腺癌组织化疗前Atg3与Beclin1蛋白的表达Western blot也显示26例化疗后有效达CR或PR的乳腺癌患者中，有23例化疗前Atg3与Beclin1蛋白在乳腺癌组织中呈现高表达，仅3例呈现低表达或无表达；另15例化疗后无效为NC或PD的患者中，有14例Atg3与Beclin1蛋白在化疗前为低表达或无表达，仅1例呈现高表达，见图2。

图2 不同疗效患者化疗前乳腺癌组织中Atg3与Beclin1蛋白表达相对比例

2.3 免疫组织化学检测不同疗效乳腺癌组织化疗前Atg3与Beclin1的表达 在化疗后有效（CR或PR）的26例乳腺癌患者中，有23例Atg3与Beclin1在化疗前癌细胞质中呈现＋＋或＋＋＋，仅3例表现为＋或-；在化疗后无效（NC或PD）的15例患者中，有14例患者化疗前Atg3与Beclin1在癌细胞质中呈现＋或-，仅1例表现为＋＋，见图3。

图3 不同疗效患者化疗前乳腺癌组织中Atg3与Beclin1免疫组织化学染色

2.4 化疗前Atg3与Beclin1表达与化疗后不同疗效的关系依据上述经ET方案新辅助化疗后不同疗效例数与化疗前乳腺癌组织中Atg3与Beclin1不同表达例数见表1。化疗前Atg3与Beclin1高表达组总有效率为95.8%（23／24），低表达和不表达组的总有效率为17.6%（3／17），化疗前Atg3与Beclin1高表达组的乳腺癌化疗有效率高于低表达和不表达组（P＜0.05）。

表1 化疗前Atg3与Beclin1不同表达组与化疗后有效率比较（n）

3 讨论

前期研究发现在乳腺癌患者接受ET方案新辅助化疗前存在多种基因的表达差异，其中自噬相关基因Atg3与Beclin1的表达差异尤为显著。因此分析化疗前相关基因表达变化与化疗疗效的关系，有助于发现化疗方案疗效预测指标。近来研究发现在肝癌中，自噬基因Atg3的过表达将通过上皮间质转化促进癌细胞的侵袭和转移[2]；另一方面Beclin1的高表达可抵抗恶性细胞的凋亡[9-11]，因而Atg3与Beclin1的表达可促进恶性肿瘤细胞无限增殖与侵袭转移等恶性行为。ET方案中，多西紫杉醇类可促进细胞微管聚合，抑制微管解聚，使纺锤体功能失常，从而抑制细胞增殖，微管蛋白的聚合、解聚也是上皮间质转化过程的重要步骤[12-14]。因而表明多西紫杉醇类可能通过抑制微管蛋白功能干扰Atg3引导的上皮间质转化过程，达到抗癌作用。而表柔比星类药物则通过直接嵌入细胞DNA核碱基对之间，干扰转录过程，阻止mRNA的形成，从而抑制DNA和RNA的合成，同时抑制拓扑异构酶Ⅱ，也抑制DNA的合成，进而可能拮抗Beclin1介导的抗凋亡作用。

本研究通过回顾性收集、检测经ET方案新辅助化疗前的乳腺癌患者病理组织标本中Atg3和Beclin1的表达，研究结果表明ET方案可能拮抗Atg3与Beclin1介导的细胞恶性行为而发挥抗癌作用产生疗效，因此化疗前Atg3与Beclin1的高表达可能预示经ET方案新辅助化疗有效。

基于雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体的乳腺癌分子分型为乳腺癌患者正确接受内分泌治疗或分子靶向治疗发挥了重要的决定性作用[15]。然而目前对于化疗方案的选择主要依赖于大规模临床试验，尚无明确客观分子选择机制。本研究发现，在Atg3和Beclin1过表达的患者，接受ET方案新辅助化疗后有效率更高，从而为患者接受ET方案新辅助化疗提供了新的导向性和理论依据。

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