分子荧光光谱结合归一化法快速判定大豆原油掺伪

李冰宁 武彦文 曹 阳 李庆鹏 祖文川 汪 雨 侯 敏 陈舜琮

(北京市理化分析测试中心 北京市食品安全分析测试工程技术研究中心1，北京 100089)(国家粮油质量监督检验中心 北京市粮油食品检验所2，北京 100162)(北京市天维康油脂调销中心3，北京 100050)

大豆原油(又称大豆毛油)是大豆通过压榨或浸提得到的粗油脂，不能直接食用，需要经过脱胶、脱酸、脱色、脱臭等精炼处理，并满足大豆成品油的质量要求才能进入消费市场。大豆原油的主要成分是三酰甘油的混合物，此外还含有纤维、泥沙、蛋白质、糖类、甾醇、维生素、脂溶性色素、磷脂等杂质，油脂精炼的目的是去除磷脂、溶剂、水分等杂质，色素、维生素等天然抗氧化剂也会不可避免地随之损失。由于大豆原油中含有丰富的维生素E、酚类等抗氧化物质，便于长期储存，而精炼后的大豆成品油则容易氧化，保质期较短。我国将大豆原油作为战略储备物资，出台相关国家标准对原油的质量指标做出规定(如酸价和过氧化值)［1］。然而，近年来我国储油市场发现一些不良商家为了让过期的大豆原油顺利通过入库检查，在原油中掺入大豆成品油。这些掺入成品油的原油往往不易存放，入库后很快就出现酸价、过氧化值急剧升高，品质迅速劣变的现象，严重扰乱了储油市场秩序，危害国家油脂储备。因此，亟须尽快开发大豆原油的掺伪判别方法，做好原油的入库把关工作。

目前，食用油掺伪鉴别的常见分析方法，如感官分析、理化检测、气相色谱、红外光谱、低场核磁共振等大多用于鉴别异种油脂掺伪，如高价的橄榄油中掺入廉价的菜籽油，花生油中掺入大豆油等［2］。大豆原油中掺入成品油属于同种油脂的掺伪，其三酰甘油的组成和比例不发生变化，因此气相色谱法、红外光谱法无法鉴别其掺伪;而且是较“复杂”的原油中掺入相对“纯净”的精炼油，感观分析和理化检测不能鉴别大豆原油和掺伪油，分析难度加大，目前，尚无有效方法满足检验需求。

荧光光谱作为一种分子光谱技术，除了具有快速、简便、低成本的优点外，还具有高灵敏度、高选择性等特点。食用油的荧光中心集中在维生素、色素和脂肪酸的C O基团上。另外，污染物如农药、黄曲霉毒素、多环芳烃类物质也具有荧光，不同的食用油脂中所含的荧光物质不同，因此表现出的荧光谱图各有差异。近年来，利用荧光光谱技术鉴别食用油真伪和掺伪的研究越来越多［3］:同步荧光光谱结合化学计量学已用于橄榄油产地判别及掺伪分析，最低检出限可以达到 5% 以下［4－8］;田萍等［9］利用二维相关荧光光谱鉴别大豆油、芝麻油等4种植物油。基于此，本试验通过大量样本研究，建立了直接采用荧光谱图结合谱峰强度归一化法判别大豆原油掺伪的方法。从而为大豆原油开发一种简便、快速、低廉的掺伪分析方法，为原油的入库质量把关提供了有力技术支持。

1 材料与方法

1.1 样品与试剂

大豆原油:天津九三油脂厂和北京市天维康油脂调销中心，系美国、阿根廷、巴西进口大豆加工，共28个样品;大豆成品油:全国各地市场收集的不同等级大豆油，共26个样品。样品的收集时间为2012年10月～2013年7月。掺伪油是将多个大豆原油中掺入不同比例不同来源的大豆成品油(2%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%，w/w)，共56 个样品。所有样品存放于塑料瓶中，充入氮气后密封，置于4℃冰箱避光保存。叶绿素和β－胡萝卜素(30.9%)购自中国食品药品检定研究院。

1.2 试验仪器与参数设置

FT－97pro荧光分光光度计:中国上海棱光;F－4600荧光分光光度计:日本日立。参数设置:激发波长360 nm，激发狭缝5 nm，发射狭缝5 nm，光谱带宽1 nm，发射光谱采集范围370～800 nm。

1.3 试验方法和数据处理

将样品直接注入10 mm×10 mm×45 mm石英比色池，直角放置扫描，每个样品平行采集3次。所得谱图采用Origin pro 8.0软件分析处理。

2 结果与讨论

2.1 大豆原油和大豆成品油的发射荧光谱图

大豆原油经过脱胶、脱酸、脱色、脱臭等精炼过程后得到大豆成品油，因此，大豆原油及其精炼油的脂肪酸组成几乎完全相同，无法通过脂肪酸组分差异辨别。但原油中的色素等“杂质”成分较成品油多，因此它们的荧光谱图不尽相同。本试验以不同的激发波长扫描样品，分析和比较2类样品的激发谱图和发射谱图，结果表明:当固定激发波长为360 nm时，大豆原油及大豆成品油在370～800 nm范围的发射谱图的特征性最好，表现出的共性差异也最明显(图1)。

分析大豆原油和成品油的荧光谱图的谱峰强度，发现原油的荧光强度远远低于成品油的，这可能是原油中的成分多，荧光物质之间会发生自吸作用;同时干扰荧光物质的成分也会引发荧光物质淬灭;成品油的荧光物质(如抗氧化剂维生素E)则受基体的干扰较小，表现出较强的荧光谱峰。图2～图3为添加入不同量的叶绿素和类胡萝卜素的大豆原油和成品油的荧光谱图。结果表明:随着油品中色素成分的含量增加，原油和成品油的荧光强度降低，其中成品油的荧光强度下降更快，说明油品中的色素物质的自吸作用以及对荧光物质的淬灭效果明显。

图1 大豆原油(a)和大豆成品油(b)在370～800 nm发射范围的发射荧光谱图

从谱峰的位置分析，大豆原油在388 nm处有1个弱荧光峰，在525 nm和676 nm处有较强荧光特征峰;成品油则在417 nm处出现强的宽峰。其中417 nm处的宽峰为成品油中不饱和脂肪酸及氧化产物的羰基及维生素E等物质的混合峰，525 nm处的强峰可归属为生育酚和其他酚类物质［10］;676 nm处的强峰为色素类物质(表1)。据此推断525 nm和676 nm处的谱峰与类胡萝卜素和叶绿素等色素类物质相关［11－12］。

表1 大豆油的荧光谱峰归属

图2 大豆原油(a)与大豆成品油(b)中添加不同水平的叶绿素的发射荧光谱图

图3 大豆原油(a)与大豆成品油(b)中添加不同水平的类胡萝卜素的发射荧光谱图

在荧光分析中，选择不同激发波长激发会得到不同的发射谱图，因此，人们常常选择同步荧光法。即固定激发波长与发射波长的波长差，得到相对稳定的发射谱图。试验表明，同步荧光鉴别油品真伪具有优势，但掺伪分析的效果不甚理想，必须结合较为复杂的化学计量学方法才能达成［8－9，13－15］。本研究在大量试验的基础上，找到大豆原油及其成品油的荧光谱图呈现最大差异的荧光采集条件，从而以更为简便的方法判定掺伪。此外，荧光光谱受测定条件的影响较大，不同溶剂溶解样品得到的谱图差异很大，因此，采用直接测定，固定条件对得到稳定的谱图具有现实意义。

2.2 大豆原油掺入大豆成品油的发射荧光谱图

由于大豆原油及其成品油的荧光谱图差别显著，因此，尝试通过几组不同来源的大豆原油及成品油的混合油的荧光谱图变化来判定原油是否掺伪。图4是大豆原油中掺入不同比例的大豆成品油后发射荧光谱图，谱图中各谱峰位置和强度呈逐步变化趋势。可以明显看出:随着混合油中成品油的比例增大，位于388 nm处的荧光峰的强度明显增强，其峰位也向长波段移动(红移)，同时位于525 nm处的荧光峰强度也随成品油比例的增加而增强，峰位则向短波段移动(蓝移)。这可能与成品油中色素含量较低，而脂肪酸及其氧化产物含量较高有关。值得注意的是:大豆原油中388 nm处峰的强度明显弱于525 nm处的荧光峰。但是，随着混合油中成品油的比例逐步增加，388 nm处的荧光峰后来居上，谱峰强度逐渐超过525 nm处的峰强。因此，通过这2个谱峰的强度比值可以直接确定原油中是否掺入成品油，并对掺伪油的比例进行半定量分析。需要说明的是，本试验没有选取676 nm处的强峰作峰强比的原因是不同来源、不同成熟度的大豆中叶绿素的含量差异较大，由此得到的大豆原油的荧光谱图中的676 nm处的叶绿素的峰强差别较大。

图4 大豆原油及掺入不同比例大豆成品油的二元体系的发射荧光谱图

2.3 应用掺伪指数(I a)判定大豆原油掺伪

为了找到大豆原油是否掺入大豆成品油的判定方法，本试验定义了掺伪指数(Ia)。首先为了消除不同仪器条件下荧光谱峰强度的变化，掺伪指数规定采集谱图的荧光分光光度计的激发狭缝和发射狭缝均固定为5 nm，同时固定激发波长为360 nm;样品采集采用直接放入10 mm×10 mm×45 mm石英比色池，直角放置扫描方式，扫描370～800 nm范围的发射荧光谱图。读取谱图中388 nm和525 nm处的谱峰强度I388和I525。掺伪指数(Ia)的计算采用归一化方法处理，即假设525 nm处的荧光峰强度为1，将388 nm处谱峰强度与525 nm处的峰强作归一化处理，得出相对荧光强度的比值(I388/I525)。为方便比较，将比值乘以100，即得到如下公式:

Ia= I388/I525×100

式中:Ia为掺伪指数;I388为样品在388 nm处荧光谱峰的强度;I525为样品在525 nm处荧光谱峰强度。

本试验采用不同厂家的仪器对不同来源的大豆原油、大豆成品油以及不同比例的混合油的Ia值进行测定。由图5可知:在上述试验条件下，不同厂家和型号的荧光分光光度计测得Ia值具有相对稳定的取值范围，其中大豆成品油的Ia值在120～250之间，其取值的变化范围较大，可能与成品油的不同精炼工艺有关;纯大豆原油的Ia值为16～20之间。这些大豆原油的过氧化值范围在2.42～6.33，说明不同氧化程度原油的荧光谱图具有较好的稳定性。综上，Ia值的设定对大豆原油的掺伪具有普适性。比较Ia的数值，发现大豆成品油比例大于10%的混合油的Ia值均大于20，而不同来源和氧化程度的纯大豆原油的Ia值均低于20，说明20可以作为一个判别原油是否掺伪的指标。经验证，掺入10%成品油的大豆原油在低浓度掺伪样本中误判率最低，掺伪浓度更低的样本易被判别为大豆原油。因此，该方法的最低检出限为掺伪量10%。

图5 大豆原油中掺入不同比例大豆成品油的掺伪指数

3 结论

在一定的荧光测定条件下，大豆原油与大豆成品油的发射荧光谱图的共性差异十分明显，其中原油在388、525、676 nm处有不同强度的特征峰;成品油则在417 nm处出现强的宽峰。根据原油中掺入成品油后位于388和525 nm处的峰强比例发生明显变化，本试验定义了大豆原油的掺伪指数(Ia)作为判定原油中掺入成品油的参数，当Ia大于20时，可以判定大豆原油掺伪。该方法最低检出限为掺伪量10%的大豆原油掺伪。本试验建立的判定方法无损、简便、快速、成本低廉(只需一台普通的荧光分光光度计);数据处理直接采用原始谱图的峰位峰强读取，方法简单、易于操作，有利于推广到储油企业用于大豆原油储备的入库把关检验。

［1］GB 1535－2003大豆油［S］

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