山药蛋白酶解条件及其响应面法的优化

徐梦辰 丁 轲 吕 莹 许 丽 韩 涛 卞 科

(北京农学院食品科学与工程学院1，北京 102206)(河南工业大学2，郑州 450052)

山药(Dioscoreae opposite Thumb)是一种药食兼用性植物，具有抗氧化、延缓衰老、免疫调节、降血糖、血脂以及调节脾胃、调节体内酸碱平衡等功能［1－2］。近年来，对于山药功能因子的研究多集中于山药蛋白质和山药糖蛋白的提取纯化及其功能性质，如分离出的山药糖蛋白组分CYG1和CYG2，体外对α－葡萄糖苷酶具有明显的抑制作用［3－4］;山药蛋白质则具有抗氧化活性［5－6］。认识山药蛋白水解物的功能活性是了解山药保健功能的重要组成部分。但目前山药蛋白水解物和山药多肽的研究仅有少量报道，而对山药蛋白酶解制备抗氧化肽的研究鲜见报道。

本研究以碱性蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶分别酶解山药蛋白，以水解度(DH)和抗氧化能力(还原能力、H2O2清除率和ABTS自由基清除率)为指标，评价酶解效果。选择其中较为合适的酶，根据单因素试验结果，采用中心组合试验设计(Central Composite Design，CCD)以及响应面法(Response Surface Methodology，RSM)分析各因素与响应值、各因素之间的相互影响，并对各水解因素进行优化，初步确定制备山药多肽的最佳工艺参数，为进一步确定山药多肽的功能性质提供依据。

1 材料与方法

1.1 原料

鲜山药:市售。

1.2 主要试剂

碱性蛋白酶(200 U/mg)，胰蛋白酶(250 U/mg):北京百诺威生物科技有限公司;中性蛋白酶(60 U/mg):博尔优生物。

1.3 酶解底物的制备

1.3.1 山药蛋白等电点确定

称取10 g山药泥，加入蒸馏水80 mL，搅拌均匀。调节pH 8.0，40 ℃［7］水浴3 h，4 000 r/min 离心10 min，留上清液。沉淀用10 mL蒸馏水洗涤，4 000 r/min离心10 min。合并2次离心得到的上清液。

分别以梯度为1.0，pH范围3.0～7.0;梯度为0.5，pH 范围3.0～6.0;梯度为0.2，pH 范围3.5～4.9;梯度为0.1，pH范围4.0～4.6;调节山药蛋白提取液的pH，静置过夜，8 000 r/min离心10 min，弃去上清液。将所得沉淀在30℃烘箱中干燥至恒重。计算山药蛋白得率，测定蛋白浓度。

蛋白得率=［蛋白质质量(g)/山药质量(g)］×100%

1.3.2 山药蛋白粗提物制备

山药洗净、去皮、切块、打浆。称取100 g山药泥，加入蒸馏水800 mL，搅拌均匀。调节 pH 8.0，40℃水浴3 h，4 000 r/min离心10 min，留上清液。沉淀用100 mL蒸馏水洗涤，4 000 r/min离心10 min。合并上清液。用0.1 mol/L HCl调节pH至等电点，静置，8 000 r/min离心10 min，弃去上清液，收集沉淀，冻干备用。

1.4 山药蛋白的酶解

选取中性蛋白酶、碱性蛋白酶和胰蛋白酶分别水解山药蛋白粗提物，按照推荐的蛋白酶最适条件，称取一定质量的蛋白酶进行酶解。酶解过程中滴加NaOH(0.1 mol/L)标准溶液保持酶解液的pH稳定，记录消耗的NaOH溶液体积。酶解结束后，沸水浴条件下5 min，灭酶。水解过程中维持反应溶液的pH和温度恒定。测定水解度及稀释10倍后的抗氧化能力。

1.5 水解度(DH)的测定

采用pH－Stat法测定酶解过程的水解度［8］。具体计算方法参照苏海玲等［9］的方法，其中每克原料蛋白质中肽键的毫摩尔数(htot)取8.2 mmol/g。

1.6 抗氧化活性测定

1.6.1 还原能力测定

采用普鲁士兰法［10］。

1.6.2 对H2O2的清除作用

采用辣根过氧化物酶法［11］。

1.6.3 对ABTS自由基的清除作用

ABTS自由基清除能力测定方法［12］。

1.7 酶解山药蛋白单因素试验及响应面法优化

以蛋白的水解度及酶解物还原能力为评价指标，对酶解工艺中的底物质量浓度(1、2、3、4、5 mg/mL)、酶底比(g 酶/g 干蛋白)(1∶100、1∶80、1∶60、1∶40、1∶20)、酶解温度(40、45、50、55、60 ℃)及 pH(7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)进行单因素试验。在测定某一因素的最佳条件时，固定其他单因素的条件不变。

根据上述单因素试验结果，选择还原能力为指标，酶底比、温度、pH 3个因素为自变量。采用中心组合原理，设计试验。对酶解山药蛋白的工艺进行响应面分析，优化酶解工艺。试验数据及结果均使用Design－Expert软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 山药蛋白等电点确定

通过梯度调节pH，逐渐缩小pH范围，得到如图1所示结果。在pH 4.3时，蛋白浓度和蛋白质得率均达到最高。由此可以确定，山药蛋白的等电点为4.3。

图1 不同pH值对山药蛋白浓度与蛋白得率的关系

2.2 3个蛋白酶酶解山药蛋白的效果评价

2.2.1 3个蛋白酶酶解山药蛋白的水解度指标

山药蛋白在3个蛋白酶作用下，水解度指标有着相似的变化趋势，即水解初期水解度迅速上升，一定时间后趋于平缓，直至基本保持不变(图2)。在中性蛋白酶作用下，水解度在300 min内迅速增加，达46.96%;随后，水解度虽有增加，但增加幅度略有减小，在600 min时水解度为53.02%;在碱性蛋白酶作用下，水解度在90 min内迅速增加，达到15.95%;90～300 min增速略有减小，水解度达23.23%;随后变化平缓，600 min时水解度仅为25.77%;胰蛋白酶对山药蛋白的水解趋势与碱性蛋白酶十分相似，90 min时水解度为6.77%，300 min为9.69%，600 min为11.07%。3个蛋白酶在其最适条件下对蚕豆蛋白的水解存在明显且较大的差异。

图2 不同时间3个蛋白酶酶解山药蛋白的水解度

2.2.2 3个蛋白酶酶解山药蛋白产物的抗氧化活性

碱性蛋白酶和胰蛋白酶酶解产物的还原能力高于中性蛋白酶(图3a)，在DH小于10%的范围内，胰蛋白酶还原能力高于碱性蛋白酶;大于10%，碱性蛋白酶的还原能力逐渐升高，在20%～25%时，还原能力明显好于胰蛋白酶。

H2O2清除率的效果由高到低依次是碱性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶(图3b);其中，中性蛋白酶H2O2清除率随DH升高而降低;碱性蛋白酶、胰蛋白酶的H2O2清除率在DH达到10%左右时达到最高，且碱性蛋白酶的效果好于胰蛋白酶。

碱性蛋白酶ABTS自由基清除率高于其他2个酶，且在DH达到20%～25%时ABTS自由基清除率最高(图3c);碱性蛋白酶和胰蛋白酶酶解液的ABTS自由基清除能力随山药蛋白水解度的增加呈增大趋势，在水解度分别为0%～25%和0%～10%范围内，呈明显的相关性，相关系数R2分别为0.918、0.959，但中性蛋白酶的相关性不好。

中性蛋白酶的水解度很高，高于碱性蛋白酶和胰蛋白酶，但是其抗氧化能力不如碱性蛋白酶和胰蛋白酶。因此，选取碱性蛋白酶，且控制DH达到20%～25%(即酶解4 h)，进行下一步试验。

2.3 碱性蛋白酶酶解山药蛋白单因素试验

2.3.1 底物浓度对山药蛋白酶解效果的影响

图3 3个蛋白酶酶解山药蛋白的水解度与还原能力、H2 O2清除率、ABTS自由基清除率的关系

由图4a可见，随底物浓度增大，山药蛋白水解度DH减小，且底物质量浓度为4 mg/mL和5 mg/mL的水解度相差不大;还原能力则随底物浓度增大而逐渐升高，即底物浓度越高其酶解后的还原能力也越大。当底物质量浓度为1～4 mg/mL时，DH与还原能力呈良好的线性关系，其相关系数R2=0.957。由于反应物质量分数过高，底物的黏度增加，对蛋白质与酶的结合有一定的抑制作用，导致水解度下降［13］。所以综合考虑，选择底物质量浓度为3 mg/mL。

2.3.2 酶底比对山药蛋白酶解效果的影响

当酶底比由1∶100逐渐增加到1∶60时，还原能力随着加酶量的增加而增大，DH缓慢增大;当酶底比达到1∶20时，DH迅速增大，还原能力较酶底比为1∶60时也增大(图4b)。即在底物浓度一定的情况下，底物的水解度取决于蛋白酶的量［14］。还原能力基本上也随酶底比增加而增大。确定最适合酶底比为 1∶20。

2.3.3 温度对山药蛋白酶解效果的影响

当温度40～50℃时，山药蛋白DH随温度升高有较大幅度的增大;50℃后随着温度升高，DH继续增大，但其变化趋势趋于平缓(图4c);即在该温度范围下酶的活性随着温度的升高而增加。40～50℃随着温度升高还原能力略有升高;50℃以后随着温度的不断升高，还原能力却逐渐下降，可能是水解程度较大导致之前具有还原能力的酶解产物又被进一步水解。因此，最适宜的酶解温度选择50℃。

2.3.4 pH对酶解效果的影响

随pH增加，山药蛋白水解度明显增大;即该碱性蛋白酶在pH 7.0～9.0范围内的活性随pH升高而增大(图4d)。pH为7.0～8.5时，水解产物的还原能力随pH升高而逐渐增大;pH为9.0时，水解产物的还原能力较之前有所下降。因此，酶解反应的最适pH值选择8.5。

图4 不同酶解条件与酶解山药蛋白还原能力与水解度的变化关系

2.4 中心组合试验和响应面分析法优化山药蛋白酶解反应条件

2.4.1 中心组合试验设计

根据上述碱性蛋白酶单因素试验的最适结果，以还原能力为指标，选定酶底比、温度、pH为自变量，酶解4 h。采用中心组合原理设计试验。对碱性蛋白酶酶解山药蛋白的工艺进行响应面分析，优化酶解工艺。试验设计及结果见表1。

表1 山药蛋白酶解的CCD试验设计表及其试验结果

2.4.2 回归方程建立及方差分析

响应面回归方程的建立和方差分析见表2。模型的显著性为极显著，回归方程的失拟检验不显著(P=0.246 3＞0.05)，说明所选二次回归模型拟合度良好，可以用此模型来描述此组试验数据。方差分析知，酶底比和温度的一次项及二次项对碱性蛋白酶酶解山药蛋白还原能力的影响均达到了极显著水平;酶底比和温度的交互作用显著，其他交互作用不显著;各因素F值对山药蛋白还原能力的影响大小顺序为:酶底比＞温度＞pH。根据上述结果建立的还原能力与三因素的数学回归模型为:Y=0.40+0.030A－7.442×10－3B－1.712×10－3C+4.500×10－3AC+7.339 ×10－3B2－0.036AB2。

2.4.3 酶底比和温度的交互作用对响应值影响分析酶底比(1∶40～1∶13)和温度(45～55 ℃)对碱性蛋白酶酶解山药蛋白水解度的交互影响如图5所示。酶底比与温度对山药的交互作用显著(表2)，且酶底比对酶解山药蛋白还原能力的影响大于温度对酶解山药蛋白还原能力的影响;随酶底比的升高，还原能力呈增大趋势。

表2 山药蛋白酶解的回归方程及方差分析

图5 酶底比和温度对碱性蛋白酶酶解山药蛋白还原能力的交互影响

3 结论

3.1 以蛋白浓度和蛋白质得率为指标，梯度调节pH，确定山药蛋白等电点为4.3。提取山药蛋白条件，温度40 ℃、料液比 1∶8、pH 8.0，提取时间 3 h。此条件下蛋白粗品提取率为1.51%。

3.2 根据酶筛选结果，碱性蛋白酶酶解物的还原能力、H2O2清除能力、ABTS自由基清除能力都大于胰蛋白酶和中性蛋白酶。所以，选择碱性蛋白酶，且DH达到25%左右(即酶解反应4 h)为佳。

3.3 在单因素试验基础上，以中心组合设计和响应面分析法对山药蛋白酶解条件进行优化，酶底比与温度对酶解山药蛋白还原能力的交互作用显著，各因素对山药蛋白还原能力的影响大小顺序为:酶底比＞温度＞pH;根据回归方程得到最优水解条件为:酶底比1∶13，温度50℃，pH 8.5，在此条件下，山药蛋白酶解多肽的还原能力理论值为0.430，经验证实际测得该条件下还原能力为0.432，标准偏差为0.1%，与理论值相符。试验模型能较好地反应实际酶解情况。

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