E-cadherin在经动脉栓塞治疗肝癌时的表达及其与肝癌肺转移的关系

张巍　钱晟　瞿旭东　朱梁　周波　杨国威　王建华　刘嵘　颜志平

(复旦大学附属中山医院介入治疗科，上海　200032)



·论著·

E-cadherin在经动脉栓塞治疗肝癌时的表达及其与肝癌肺转移的关系

张巍钱晟瞿旭东朱梁周波杨国威王建华刘嵘颜志平

(复旦大学附属中山医院介入治疗科，上海200032)

摘要目的：对大鼠肝癌模型行经动脉栓塞治疗，探讨栓塞治疗对肝癌肺转移及E-cadherin表达的影响。方法： 选取40只Buffalo大鼠，建立稳定表达绿色荧光蛋白的大鼠肝癌模型。将大鼠随机分成4组，每组10只。对照组(A组)：胃十二指肠动脉逆行插管，注入0.9%氯化钠液0.2 mL；肝动脉结扎组(B组)：分离肝动脉后用缝线结扎；小剂量栓塞组(C组)：胃十二指肠动脉逆行插管，注入超液化碘油(0.2 mL/kg)；大剂量栓塞组(D组)：胃十二指肠动脉逆行插管，注入超液化碘油(0.4 mL/kg)。术后观察体质量及肿瘤变化。21 d后处死大鼠，收集肝和肺标本，观察肿瘤生长变化及肺转移情况。采用实时荧光定量-聚合酶链反应法、蛋白质印迹法、免疫组织化学法检测肿瘤组织中的E-cadherin的mRNA及蛋白表达水平。结果：术后 21 d，D组肝脏肿瘤生长较其他3组明显受抑；B、C组肝脏肿瘤生长较A组明显受抑(P<0.01)。D组肺转移个数少于其他3组(P<0.01)。D组E-cadherin mRNA和蛋白相对表达水平高于A、B、C组，差异均有统计学意义(P<0.01)。D组E-cadherin阳性细胞百分比高于其他3组，差异均有统计学意义(P<0.01)。结论：在大鼠肝癌模型中，经动脉栓塞治疗肝癌可增加E-cadherin表达，大剂量的碘油栓塞能抑制肿瘤生长，降低肺转移。

关键词肝癌；栓塞；大鼠；肺转移；E-cadherin

基本项目：国家自然科学基金资助项目(编号：81171432；81350031)

中国是肝癌发病率最高的国家。中国肝癌患者约占世界肝癌患者的55%，其中以肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)居多[1]。目前，对于不具备手术切除条件的肝癌患者，临床上多采用以介入治疗为主的治疗方法，例如经肝动脉化疗栓塞术(transarterial chemoembolization，TACE)已成为不具备手术切除条件的肝癌患者的最主要选择[2]。但如何评价TACE治疗效果则是当前的重要议题。E-cadherin作为一种细胞黏附分子，是介导细胞间黏附、保持上皮细胞形态和结构完整的关键分子，其结构改变或数量增减均会影响细胞分化和组织形态，可导致癌细胞的脱落和转移[3]。同时，E-cadherin是重要的肿瘤转移抑制基因，其表达与肝癌的侵袭转移呈负相关[4]。本研究拟对大鼠肝癌模型行经动脉栓塞(transarterial embolization，TAE)治疗，旨在探讨TAE对肝癌肺转移及E-cadherin表达的影响。

1资料与方法

1.1细胞与动物大鼠肝癌McA-RH7777细胞株中(购自美国ATCC)加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，于37 ℃、CO2体积分数为5%的细胞培养箱中培养。

SPF级近交系Buffalo大鼠，8周龄、雄性、体质量(220±3)g，购自美国Charles River Laboratory，复旦大学附属中山医院动物中心饲养。

1.2主要试剂与仪器DMEM高糖培养基(美国Gibco BRL公司)；胰酶消化液(美国Difco公司)；Trizol(美国Invitrogen公司)；实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction，real-time PCR)试剂盒(美国Promega公司)；蛋白质印迹(Western blotting)试剂盒(美国Millipore公司)；Puromycin(美国Sigma-Aldrich公司)；小鼠E-cadherin单克隆抗体、小鼠β-actin单克隆抗体(美国Abcam公司)；山羊抗小鼠IgG抗体(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)；超液化碘油(法国Gubert公司)；Silastic laboratory tubing(美国Dow Corning公司)；体视显微镜(日本Nikon公司)；1.5T超导磁共振成像仪(配小动物专用线圈，德国Siemens公司)；荧光显微镜Leica M205(德国Leica公司)；Carestream多模式小动物成像系统(北京东胜创新生物科技有限公司)。

“见到静秋，很偶然。前些日子和楚歌去一家茶馆喝茶，竟然见到她。茶馆是她和她老公的，已经开了两年多。一直没告诉你，是怕你多想。再说，有什么可告诉你的呢？静秋现在只是我的朋友，我总不能每交一个朋友，都要向娘子汇报吧？静秋是我的初恋，这不假，可是时间过去了这么久，当初再旺的一团火，也早熄灭了。昨天晚上，真的没打算叫她。楚歌和莫高都在，你不相信的话，现在就可以给他们打个电话……”

2.1大鼠生物学行为及体质量变化术后3 d各组大鼠均进食差，其中D组进食最差，A、B、C组在3 d后进食恢复正常；术后14 d各组大鼠活动差、毛发欠光泽，部分肛门口出现污秽等。4组大鼠术前体质量差异无统计学意义。D组大鼠体质量在术后5 d逐渐增加，D组大鼠术后7 d体质量为(247.9±13.13)g，但较术前[(264.8±12.27)g]下降(P<0.05)；术后21 d时的体质量为(243.4±18.71)g，与A组[(217.9±17.76)g]比较差异有统计学意义(P<0.05)，与B、C组差异无统计学意义。见图2。

里帕的借鉴方式简单直接：如拟人形象“友谊”（方案D），他说“一个瞎子背着一个瘸子行路”的形象来表现“友谊”主题，是出自阿尔恰托的描述：“他在一个瞎子的背上，用声音领路。所以两人组合在一起意味着，一个提供视力一个提供脚力”。㉖

A：McA-RH7777细胞；B：McA-RH7777/EGFP细胞

图1McA-RH7777/EGFP细胞在荧光显微镜下

激发荧光后显示绿荧光(×200)

1.3.2实验动物分组及治疗选取造模后的Buffalo大鼠40只。造模后7 d经磁共振扫描证实肝内成瘤，40只大鼠成瘤率达100%。在造模后17 d，按照随机数字表将大鼠随机分为4组，每组10只。对照组(A组)：开腹行胃十二指肠动脉逆行插管，注入0.9%氯化钠液0.2 mL；肝动脉结扎组(B组)：开腹分离肝动脉后用缝线结扎；小剂量栓塞组(C组)：开腹行胃十二指肠动脉逆行插管，注入超液化碘油(0.2 mL/kg)与0.9%氯化钠液(碘油∶0.9%氯化钠液=1∶2)；大剂量栓塞组(D组)：开腹行胃十二指肠动脉逆行插管，注入超液化碘油(0.4 mL/kg)与0.9%氯化钠液(碘油∶0.9%氯化钠液=1∶2)。

2.4E-cadherin检测结果real-time PCR结果发现，D组E-cadherin mRNA的相对表达水平[(1.66±0.38)]高于A组[(0.99±0.39)]、B组[(0.80±0.23)]、C组[(0.86±0.24)]，差异均有统计学意义(P<0.05)；A、B、C组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图4a。Western blotting分析结果显示A、B、C、D组E-cadherin蛋白的相对表达水平分别为(0.13±0.06)、(0.12±0.04)、(0.13±0.03)、(0.32±0.09)，D组高于A、B、C组，差异均有统计学意义(P<0.01)；A、B、C组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图4b和图5。免疫组织化学结果显示，E-cadherin为包膜染色，在肿瘤组织中表达量偏低，D组计数阳性细胞百分比为(18.60±3.78)%，与A组[(9.90±1.85)%]、B组[(8.10±2.81)%]、C组[(10.70±2.16)%]比较，差异均有统计学意义(P<0.01)；A、B、C组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图4c和图6。

正常肝组织的血供70%～75%来源于门静脉，25%～30%来源于肝动脉。肝癌组织的血供中95%～99%由肝动脉供给，阻断肝动脉后，肿瘤血供减少90%，而正常肝脏组织血供一般不受影响。肿瘤组织对于缺血、缺氧敏感性较高，肿瘤血管粗细不等、血流缓慢、发育不全，且有虹吸现象，能够使化疗药物和栓塞剂滞留在肿瘤血管内。因此，TACE治疗肿瘤时，经肝动脉选择性地将化疗药注入病灶内，可以使肿瘤组织中的药物浓度比正常肝组织高10倍以上，肿瘤细胞坏死明显，而正常肝脏受影响小；术中注入的栓塞剂能够栓塞毛细血管、小动脉及动脉主干，造成肿瘤局部血供中断或明显减少，从而减少血流进入化疗药物滞留的血管处，使化疗药物缓慢释放，进而导致肿瘤局部缺血、坏死，延长患者生存期[5]。选择TACE的患者主要为不能手术切除的中晚期肝癌患者，所以，对于TACE是否会促进肝癌转移一直有争议。有研究[6]认为，部分肝癌患者对手术前TACE治疗无效，且术前如多次TACE治疗可使肝脏明显受损，导致肝组织水肿，降低患者对肝切除的耐受能力，增加手术难度，且术后并发症发生率和病死率增加；同时，TACE后，残留的肿瘤细胞侵袭能力增加、黏附力下降，从而增加肿瘤转移机会。但另有研究显示，肝癌患者从TACE中获益：Llovet等[7]的一项随机对照研究显示，TACE组的1、2年生存率为83%、63%，而保守治疗组为63%、27%，差异有统计学意义(P<0.01)；Lo等[8]报告，TACE组1、3、5年的生存率为57%、31%、26%，而对照组为32%、11%、3%，差异有统计学意义(P<0.01)。

定义1[12] GF(q)(q≠2)上生成多项式g(x)包含αl0,αl0+1,…,αl0+2t-1等2t个连续根的本原BCH码称为RS码.

1.3.5术后各部位肿瘤灶观察术后21 d，给予10%水合氯醛麻醉后处死大鼠。采用荧光显微镜及小动物成像系统观察肝内肿瘤、肺部转移等情况。由2位研究者在荧光显微镜下结合小动物成像系统，记录肺部转移灶并分级：Ⅰ级直径小于0.5 mm；Ⅱ级直径0.5～1.0 mm；Ⅲ级直径1～2 mm；Ⅳ级直径大于2 mm。总转移灶数=Ⅰ级(结节数)×1+Ⅱ级×2+Ⅲ级×3+Ⅳ级×4。根据总转移灶数分级：1～20个为Ⅰ级，21～40个为Ⅱ级，40个以上为Ⅲ级。

2.3各组肺转移情况术后21 d，所有大鼠均有肺转移，肺转移率为100%。用Fisher精确概率计算P值。D组Ⅰ、Ⅲ级与A、B、C组两两比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；A、B、C组两两比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

虽然糖尿病史遗传因素和环境因素共同作用的结果[3]，但生活方式也是影响糖尿病患病与控制的重要因素[4]，研究显示，通过健康促进与健康教育改变患者生活方式能够降低糖尿病及其并发症的发生率[5]，生活方式干预是控制糖尿病前期患者血糖的有效手段[6,7]。但如果仅仅采用常规健康教育，而缺乏有效的督促和监督，患者往往执行力低、依从性差，使得生活方式干预不能有效地发挥作用。本课题利用微信通讯手段发挥督促和监督作用，有效地干预了患者的生活方式，提高患者执行力和依从性，从而发挥了良好的血糖控制作用。

1.3方法

2结果

1.3.1稳定表达绿色荧光蛋白大鼠肝癌模型的建立通过包装慢病毒载体，将携带增强型绿色荧光蛋白(enhance green fluorescent protein，EGFP)的慢病毒转染至McA-RH7777细胞株，并进行筛选和单克隆，构建出表达绿色荧光蛋白的单克隆细胞株，见图1。McA-RH7777/EGFP细胞株皮下注射形成成瘤后，制备瘤组织块；直视下开腹，将瘤组织块种植到Buffalo大鼠的肝脏，制备大鼠肝癌模型。

图2　各组大鼠术后体质量变化

2.2肝内肿瘤体积变化术前各组肝内肿瘤体积差异无统计学意义。术后7、14、21 d，B、C、D组肝内肿瘤体积小于A组，D组肝内肿瘤体积小于B、C组。D组术后21 d肝内肿瘤体积为(2208.7±288.21)mm3，与A组[(4189.8±633.07)mm3]比较，差异有统计学意义(P<0.01)。B组为(2947.1±382.67)mm3，与C组[(2778.5±329.15)mm3]比较，差异无统计学意义；与A、D组比较，差异均有统计意义(P<0.05)。见图3。

图3　各组大鼠术后肝内肿瘤体积变化

1.3.6E-cadherin的检测取保存于液氮中的瘤组织，采用real-time PCR、Western blotting法检测E-cadherin的表达；取保存于甲醛中的同编号的瘤组织，采用免疫组织化学法检测E-cadherin阳性细胞。其中E-cadherin上游引物：5′-CCCTGTCTCTGAATCCAACC-3′，下游引物：5′-TCAATGATGAAAACGCCAAC-3′。小鼠E-cadherin单克隆抗体稀释浓度：免疫组织化学法为1∶200、Western blotting法为1∶1000。

表1　各组治疗后肺转移灶分级情况比较　　 (n，%)

注：与B组比较，*P<0.05；与A、C组比较，△P<0.05

1.3.3大鼠一般情况观察术后持续观察各组大鼠体质量变化，观察精神、进食、毛色及粪便性状。

a：real-time PCR结果；b：Western blotting结果；c：免疫组织化学结果。与A、B、C组比较，*P<0.01

图4real-time PCR、Western blotting和免疫组织化学法分别检测各组瘤组织中

E-cadherin mRNA和蛋白表达以及E-cadherin阳性细胞百分比的结果

图5　各组瘤组织Western blotting检测结果

图6　免疫组织化学法分析E-cadherin阴性细胞(×200)

3讨论

1.3.4肝内肿瘤体积变化分别于术后7、14、21 d进行磁共振扫描，记录肝内肿瘤体积。肿瘤体积(V)=最大径(a)×最小径(b)2/2。

●listen-on-v6 port 53{::1;}，此处用 IPv6的表示方法定义了该DNS服务对来自其他IP地址的查询请求不予响应，而仅仅监听在本地回环地址的53号端口。此处可以将{::1;}成{none;}，也可以简单的将该行注释掉。

有学者[9]给予肝癌动物模型肝动脉结扎模拟TAE治疗，发现TAE治疗促进了肝癌细胞的肺转移。这可能是，一方面，结扎肝动脉阻断肿瘤血供，使营养供给缺乏和分解代谢产物积聚，并在氧自由基的作用下肿瘤细胞坏死；另一方面，肝动脉结扎后，肝外的侧枝血管迅速开放，从而导致缺血再灌注损伤，造成肿瘤假性包膜结构的破坏，使肿瘤细胞突破包膜向周围肝实质浸润。同时，血液循环恢复后，残余有活力的肿瘤细胞再生增殖能力加强，使恶性程度增加。我们进行的栓塞治疗是经微导管超选择进入肿瘤血管的，注入碘油及微球等栓塞剂使肿瘤灶致密填塞，使其缺氧坏死，而且不易形成侧枝循环。但小剂量碘油栓塞会致肿瘤周边的包膜被破坏，使肿瘤细胞脱落，而且肿瘤细胞没有受到有效打击，大部分仍然存活，侵袭能力甚至较前更强，从而使瘤细胞更易入血，造成远处转移。本研究亦发现，大剂量碘油栓塞相对于小剂量碘油栓塞、肝动脉结扎治疗肝癌，TAE术后肺转移结节的个数减少，说明采用大剂量碘油进行栓塞治疗，对肺转移的进展有一定的抑制作用。

首先，不够重视识字课堂学习。当前，在小学语文识字教学中，众多的语文教师往往采取的都是常规的上课教学模式，都是希望通过讲解生字的音、形、义来教会学生识字，恰巧忽略了学生的兴趣培养，更没有适当发挥学生的创造力和想象力，从而让我们的识字课堂变得千篇一律，学生感觉枯燥乏味，渐渐地就成了完成任务式识字，这样当然不能提高识字能力。

肿瘤的进展是一个十分复杂的生物学过程。首先，肿瘤细胞从原发灶脱落，侵袭基底膜，侵入血管、淋巴管等，其中少数肿瘤细胞在脱落、侵袭过程中存活下来，并随血流、淋巴流游走到其他部位；然后，这种具有转移潜能的肿瘤细胞与靶器官的血管壁黏附，进而穿出血管形成微小转移灶，继续增殖形成与原发瘤同样类型的肿瘤。这些肿瘤生长后继续侵袭和转移。这个过程中涉及生长因子、黏附分子及细胞外基质、血管生成、机体免疫等多个环节，其中细胞黏附是一个重要环节。

E-cadherin属于Ⅰ型钙黏素家族的跨膜糖蛋白，其分子结构主要包括细胞外肽段、跨膜区和相对较小的细胞内肽段，通过catenins与肌动蛋白骨架连接，介导细胞间的黏附。E-cadherin不仅介导细胞间的黏附，而且也是胞外-胞内骨架转导通路上的关键分子，其结构改变或数量增减均影响细胞分化和组织形态。E-cadherin在癌细胞中普遍低表达、缺失或突变，与肿瘤细胞丧失接触抑制相关，是一种抑癌基因；其表达下降，导致细胞黏附性减弱，使肿瘤细胞播散、转移。E-cadherin在肝癌组织中的表达与肝癌的侵袭转移呈负相关，表达越低，肝癌侵袭转移的可能性越大。有学者[10]报告，将含小鼠E-cadherin cDNA的质粒导入缺失E-cadherin的高侵袭性细胞系，筛选出高水平稳定表达该cDNA的转染细胞进行观察，结果显示其侵袭性消失。本研究在术后21 d处死所有大鼠，并检测了肝肿瘤组织中的E-cadherin的表达情况，发现大剂量碘油栓塞组的E-cadherin的表达高于其他3组，且肿瘤肺转移数少。

本研究还发现大剂量碘油栓塞组大鼠术后体质量降低、活动能力等较差。这可能是由于在大鼠肝癌模型上难以做到真正的超选择栓塞，碘油会进入正常肝组织，使其受损，导致肝功能下降。因此，在临床进行TACE时，要做到超选择栓塞，以保护正常肝组织。

综上所述，本研究通过对大鼠肝癌模型行TAE和肝动脉结扎治疗，发现大剂量碘油栓塞治疗能够抑制肿瘤生长、降低肿瘤肺转移，其机制有待研究。

参考文献

[1]Jemal A,Bray F,Center MM,et al.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2011,61(2):69-90.

[2]Chua TC,Liauw W,Saxena A,et al.Systematic review of neoadjuvant transarterial chemoembolization for resectable hepatocellular carcinoma[J]. Liver Int,2010,30(2):166-174.

[3]Kypta RM,Su H,Reichardt LF.Association between a transmembrane protein tyrosine phosphatase and the cadherin-catenin complex[J].J Cell Biol,1996,134(6):1519-1529.

[4]Endo K,Ueda T,Ueyama J,et al.Immunoreactive E-cadherin,alpha-catenin,beta-catenin,and gamma-catenin proteins in hepatocellular carcinoma:relationships with tumor grade,clinicopathologic parameters,and patients' survival[J].Hum Pathol,2000,31(5):558-565.

[5]Kirchhoff TD,Bleck JS,Dettmer A,et al.Transarterial chemoembolization using degradable starch microspheres and iodized oil in the treatment of advanced hepatocellular carcinoma:evaluation of tumor response,toxicity,and survival[J].Hepatobiliary Pancreat Dis Int,2007,6(3):259-266.

[6]杨甲梅,沈伟峰.介入治疗在普外科的应用:肝癌的介入治疗[J].临床外科杂志,2006,14(10):615-616.

[7]Llovet JM,Real MI,Montaa X,et al.Arterial embolisation or chemoembolisation versus symptomatic treatment in patients with unresectable hepatocellular carcinoma:a randomised controlled trial[J].Lancet,2002,359(9319):1734-1739.

[8]Lo CM,Ngan H,Tso WK,et al.Randomized controlled trial of transarterial lipiodol chemoembolization for unresectable hepatocellular carcinoma[J].Hepatology,2002,35(5):1164-1171.

[9]Liu L,Ren ZG,Shen Y,et al.Influence of hepatic artery occlusion on tumor growth and metastatic potential in a human orthotopic hepatoma nude mouse model:relevance of epithelial-mesenchymal transition[J].Cancer Sci,2010,101(1):120-128.

[10]Chen WC,Obrink B.Cell-cell contacts mediated by E-cadherin(uvomorulin) restrict invasive behavior of L-cells[J].J Cell Biol,1991,114(2):319-327.

Expression of E-cadherin in Rat Model of Hepatic Carcinoma during Transarterial Embolization and Its Relationship with Pulmonary Metastasis

ZHANGWeiQIANShengQUXudongZHULiangZHOUBoYANGGuoweiWANGJianhuaLIURongYANZhipingDeptartmentofInterventionalRadiology,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China

AbstractObjective：To conduct transarterial embolization(TAE) in rat model of hepatic carcinoma and to investigate the effect of embolization on pulmonary metastasis and expression of E-cadherin. Methods: Forty Buffalo rats were chosen and rat models of hepatic carcinoma with stable expression of green fluorescent protein(EGFP) were established.Rats were randomly divided into four groups with 10 rats in each group.The control group(Group A) were treated with 0.2 mL of 0.9% sodium chloride solution by gastroduodenal artery retrograde catheterization. The hepatic artery ligation group(Group B) were treated with suture ligation after separation of hepatic artery. The low dose embolization group(Group C) were treated with lipiodol ultrafluide(0.2 mL/kg) by gastroduodenal artery retrograde catheterization. The high dose embolization group(Group D) were treated with lipiodol fluide(0.4 mL/kg) by gastroduodenal artery retrograde catheterization.Body weights,tumor volumes were evaluated after operation. At 21 d after operation, the rats were killed and the samples of liver and lung were collected. The changes of tumor growth and the situations of pulmonary metastasis were evaluated. The changes in E-cadherin mRNA and protein expression levels were detected by real-time fluorescent quantitative PCR,Western blotting and immunohistochemistry. Results: At 21 d after operation,the hepatic tumor growth was obviously inhibited in Group D, and the tumor growth in Group B or Group C was also inhibited while compared with that in Group A(P<0.01).The number of pulmonary metastasis in Group D was lower than those in the other groups(P<0.01).The levels of E-cadherin mRNA and protein in Group D were higher than those in the other groups and the differences were statistically significant(P<0.01). The rate of E-cadherin-positive cells in Group D were higher than those in the other groups according to immunohistochemistry, and the differences were statistically significant(P<0.01). Conclusions: TAE, in the treatment of hepatic carcinoma on the rat models, can promote E-cadherin expression, and high dose lipiodol embolization can inhibit tumor growth and reduce pulmonary metastasis.

Key WordsHepatic carcinoma；Embolization；Rat；Pulmonary metastasis；E-cadherin

通讯作者刘嵘，E-mail：liu.rong@zs-hospital.sh.cn

中图分类号R81

文献标识码A