CXCL10对βTC6细胞TLR4表达及细胞凋亡的影响

杨立勇， 方彦玲， 沈喜妹

CXCL10对βTC6细胞TLR4表达及细胞凋亡的影响

杨立勇， 方彦玲， 沈喜妹

摘要:目的探讨CXC趋化因子配体10(CXCL10)对βTC6细胞Toll样受体4(TLR4)表达及细胞凋亡的影响。方法体外培养βTC6细胞，0.1～10.0 ng/mL CXCL10分别干预βTC6细胞12,24,48 h后，应用Western-blot检测TLR4表达情况，流式细胞术和DNA Ladder检测细胞凋亡情况。结果与对照组比较，CXCL10干预12 h，10.0 ng/mL干预组开始出现TLR4蛋白的表达水平上调(0.840±0.049，P<0.05)；干预24 h，1.0和10.0 ng/mL 干预组TLR4的表达水平上调[分别为(0.851±0.052)和(0.893±0.030)，P<0.05]；干预48 h，1.0和10.0 ng/mL干预组TLR4的表达进一步上调[分别为(0.876±0.046)和(0.923±0.027)，P<0.05]，且各干预浓度两两比较，差别均有统计学意义(P<0.05)。CXCL10干预βTC6细胞24 h，仅10.0 ng/mL干预组细胞出现DNA梯状条带；干预时间延长至48 h，1.0和10.0 ng/mL干预组均出现DNA梯状条带。流式细胞术显示，CXCL10诱导细胞凋亡呈浓度依赖性。结论长时间高浓度的CXCL10作用将导致TLR4表达显著上调，并诱导β细胞凋亡。

关键词:趋化因子CXCL10； 胰岛/细胞学； Toll样受体4； 糖尿病

糖尿病的炎症涉及多种炎症因子，研究提示，CXC趋化因子配体10(CXC chemokine ligand-10, CXCL10)与糖尿病的病理生理机制密切相关[1-3]。CXCL10属于CXC家族的趋化因子，又名干扰素诱导蛋白10(interferon-γ inducible protein-10, IP-10)，1985年由Luster等经由干扰素-γ(IFN-γ)刺激U937细胞株后、用杂交的方法从cDNA基因库中筛选出来[2]。β细胞自身合成并分泌CXCL10是吸引CXCR3+的T细胞浸润胰岛的自身免疫损伤启动因素。Toll样受体4(Toll-like receptor 4, TLR4)是先天免疫激活炎症信号转导通路中的关键因子，近年在2型糖尿病慢性低度炎症的发病机制中的作用备受关注[4]。目前已证实，体内脂毒性直接诱导的β细胞炎性凋亡主要通过激活β细胞的TLR4，启动炎症信号级联实现[5]。本研究探讨CXCL10对βTC6细胞TLR4表达及细胞凋亡的影响，报告如下。

1材料与方法

1.1细胞及试剂小鼠胰岛素瘤细胞系(mouse insulinoma line)βTC6(美国标准生物品收藏中心)，胎牛血清、DMEM培养基(美国Gibco公司);CXCL10(美国PeproTech公司);兔抗小鼠TLR4多克隆抗体(美国Bioworld公司)，细胞凋亡-DNA Ladder抽提试剂盒(江苏碧云天生物技术研究所)；Annexin V/PI流式试剂盒(美国BD公司)。

1.2分组根据CXCL10的浓度将实验分为4组：对照组和不同浓度CXCL10干预组(0.1,1.0,10.0 ng/mL)；根据干预时间将实验分为3组：12,24及48 h干预组。

1.3方法

1.3.1分离RNA及蛋白质上述βTC6细胞用0.25%胰蛋白酶消化细胞，经洗涤、离心，加入1 mL Trizol充分裂解细胞，按照说明书分离纯化细胞核及细胞质蛋白质，纯化的蛋白质按照BCA蛋白定量试剂盒说明书测定总浓度。

1.3.2TLR4蛋白表达分析细胞裂解液裂解后分别提取质蛋白和核蛋白，用BCA试剂盒测定蛋白浓度。取等量的蛋白样品50 μg，用样品缓冲液处理，蛋白变性、SDS-PAGE胶电泳分离蛋白、电转移法使蛋白转移至PDVF膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST室温下封闭2 h以减少非特异性结合，封膜后加入TLR4抗体(1∶300)或β-Actin抗体(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜后以辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(1∶3 000)孵育，室温下轻摇2 h，TBST洗膜后用ECL化学发光法曝光显影，洗片后用Bio-Rad图像分析系统对Western-blot的条带进行扫描，然后用Quantity One软件进行分析。

1.3.3观察DNA Ladder按照细胞凋亡DNA Ladder抽提试剂盒说明书抽提DNA，用1%的琼脂凝胶电泳分析，紫外灯下拍照。

1.3.4检测细胞凋亡情况按上述方法培养细胞后以0.25%的胰蛋白酶充分消化细胞，离心、收集细胞，用PBS洗涤3遍，用100 μL缓冲液调整细胞浓度为1×106mL-1单细胞悬液。分别加入5 μL的A液及B液后，避光放置15 min。加入缓冲液，调节终体积为500 μL，于流式细胞仪上检测，用Coulter分析系统分析检测结果。

2结果

2.1CXCL10干预后βTC6细胞TLR4蛋白表达的改变(1)CXCL10干预12 h，与对照组(0.781±0.021)比较，0.1和1.0 ng/mL CXCL10干预组βTC6细胞TLR4的表达无明显变化，分别为(0.799±0.029)和(0.819±0.034)(P>0.05)；10.0 ng/mL CXCL10干预组TLR4的表达水平上调[(0.840±0.049)，P<0.05]。(2)CXCL10干预24 h，与对照组(0.794±0.023)比较，0.1 ng/mL CXCL10干预组βTC6细胞TLR4的表达无明显变化[(0.818±0.032)，P>0.05]；1.0和10.0 ng/mL CXCL10干预组TLR4的表达水平上调，分别为(0.851±0.052)和(0.893±0.030)(P<0.05)。各干预浓度两两比较，10.0 ng/mL CXCL10组TLR4的表达水平比0.1 ng/mL CXCL10组上调(P<0.05)，余各组差别无统计学意义。(3)CXCL10干预48 h，与对照组(0.784±0.030)比较，0.1 ng/mL CXCL10干预组TLR4的表达无明显变化[(0.825±0.030)，P>0.05]；1.0和10.0 ng/mL CXCL10干预组TLR4的表达水平上调，分别为(0.876±0.046)和(0.923±0.027)(P<0.05)。各干预浓度两两比较，差别均有统计学意义(P<0.05，图1)。

A、B、C、D分别为对照组及0.1,1.0,10.0 ng/mL CXCL10干预组.图1　CXCL10对βTC6细胞TLR4蛋白表达的影响Fig 1　The effects of CXCL10 on TLR4 protein expression in βTC6 cells

2.2CXCL10干预下βTC6细胞中的DNA Ladder干预12 h，不同浓度CXCL10干预组均未出现明显DNA Ladder；干预24 h，10 ng/mL CXCL10干预组出现明显DNA Ladder，0.1 ng/mL和1.0 ng/mL CXCL10干预组无DNA Ladder；干预48 h，1.0 ng/mL和10.0 ng/mL干预组均出现了不同的DNA Ladder(图2)。

A、B、C、D分别为对照组及0.1,1.0,10.0 ng/mL CXCL10干预组.图2　CXCL10对βTC6细胞DNA Ladder的影响Fig 2　The effects of CXCL10 on DNA Ladder in βTC6 cells

2.3CXCL10干预下βTC6细胞的凋亡情况经流式细胞仪检测，CXCL10干预βTC6细胞48 h，随CXCL10浓度增高(0.1～10.0 ng/mL)，凋亡细胞相应增加。与对照组(1.5±0.45)%比较，1.0和10.0 ng/mL CXCL10干预组的凋亡率差别有统计学意义，分别为(13.6±0.74)%和(20.2±0.81)%(P<0.05，图3)。

A、B、C、D分别为对照组及0.1,1.0,10.0 ng/mL CXCL10干预组.图3　CXCL10对βTC6细胞凋亡的影响Fig 3　The effects of CXCL10 on apoptosis of βTC6 cells

3讨论

糖尿病患者常伴有血浆CXCL10水平增高，CXCL10的代谢异常不仅将影响糖尿病患者体内胰岛β细胞的功能状态，而且将导致β细胞的生存障碍[1,3,6]。CXCL10对胰岛β细胞的损害可能是糖尿病患者胰岛β细胞功能失代偿的原因之一，从而为探讨炎症和糖尿病的关系提供了新的线索。研究显示，正常健康人群中血清CXCL10的浓度为41.0~186.0 pg/mL；在体外实验中，文献通常采用的CXCL10干预浓度为0.1~50.0 ng/mL[1,7]。本研究在预实验阶段曾采用含0.1~50.0 ng/mL CXCL10的DMEM培养基进行细胞培养，结果发现，高于30.0 ng/mL浓度的CXCL10容易从培养液中析出结晶，最终采用0.1,1.0及10.0 ng/mL 3种干预浓度。在干预时间的选择上，实验采用的是βTC6细胞株，每一代的最佳生长周期约72 h。实验总体设计是预先给予CXCL10干预，而后寻求相应的保护措施，结合文献，最终选择12,24,48 h 3个干预时间点。结果显示，低浓度的CXCL10干预β细胞并未发现损害作用，提示生理浓度的CXCL10并无毒性作用。当提高CXCL10干预浓度或延长干预时间时，CXCL10表现出对β细胞的损害作用，表现为β细胞TLR4蛋白的表达显著上升，且细胞出现凋亡，与文献报道一致[1]。Paroni等报道了TLR4通路可能是CXCL10诱导β细胞凋亡的途径[8]。Schulthess等报道了CXCL10可通过TLR4信号损害胰岛β细胞的功能，诱发糖尿病[9]。

本研究尚发现，TLR4蛋白表达上升出现在细胞凋亡之前，且两者的变化呈平行关系，提示CXCL10可能通过上调TLR4蛋白的表达而诱导β细胞凋亡。涉及的相关机制可能如下：CXCL10可结合于胰岛β细胞上的TLR4受体，通过MyD88依赖性路径，持续的活化PI3K-AKT及JNK等信号转导通路，诱导Caspase-3活化及PAK2的裂解，下调胰岛素mRNA的表达，使细胞葡萄糖刺激的胰岛素分泌减少，并诱导细胞凋亡。同时可能是通过MyD88非依赖型途径来上调细胞内CXCL10的表达[10]，大量炎症因子(包括CXCL10)的合成及释放反过来促进TLR4/NF-κB活化，以正反馈调节机制使NF-κB诱导活性继续增加，诱发更大量致炎因子的生成形成“瀑布效应”[11-13]。因此，CXCL10可能通过结合胰岛β细胞上的TLR4受体，启动细胞内凋亡通路直接诱导胰岛β细胞凋亡。同时通过TLR4通路，促进胰岛β细胞大量炎症因子(包括CXCL10)的合成及释放，使CXCR3阳性靶细胞向炎症病灶趋化，最终导致所有β细胞的死亡及糖尿病的发生。

糖尿病的发病机制迄今尚未完全阐明，糖尿病仍然是人类社会面临的严峻挑战。目前炎症与胰岛β细胞功能衰退的关系仍在进一步研究探讨中，继续这方面的分子机制研究，并寻求相应的靶向干预措施，从而为保护β细胞的结构和功能提供思路和依据，为糖尿病的防治提供可能的新途径。

参考文献：

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[9]Schulthess F T, Paroni F, Sauter N S,etal. CXCL10 impairs beta cell function and viability in diabetes through TLR4 signaling[J].CellMetab, 2009,9(2):125-139.

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(编辑：何佳凤)

The Intervening Effects of CXCL10-induced Impairment and TLR4 Expression in βTC6 Cells

YANG Liyong, FANG Yanling, SHEN Ximei

Department of Endocrinology, The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou 350005, China

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the changes of TLR4 expression and apoptosis in β cells induced by CXCL10.MethodsInsulinoma cell line βTC6 cells were cultured in vitro, treating with CXCL10(0.1, 1.0, 10.0 ng/mL) for 12 to 48 hours, then the expression of TLR4 of the βTC6 cells and apoptosis were determined by Western-blot, DNA Ladder and flow cytometry.ResultsCompared with the control group, the βTC6 cells intervened with CXCL10 for 12 hours at 10.0 ng/mL showed an upregulated TLR4 expression (0.840±0.049, P<0.05); when intervened for 24 hours, the upregulated TLR4 expression was shown for the intervention with CXCL10 at 1.0 and 10.0 ng/mL (0.851±0.052 and 0.893±0.030 respectively, P<0.05); when intervened for 48 hours, further upregulated expressions were shown for the intervention with CXCL10 at 1.0 and 10.0 ng/mL (0.876±0.046 and 0.923±0.027 respectively, P<0.05).Statistical analysis of each two CXCL10 intervention groups showed significant differences (P<0.05).When the βTC6 cells were intervened with CXCL10 for 12~24 hours, DNA Ladder appeared at 10.0 ng/mL, while the DNA Ladder appeared at both 1.0 and 10.0 ng/mL if the intervention time period was extended to 48 hours.ConclusionsCXCL 10 at high concentration and long intervention time could change the expression of TLR4 and induce βTC6 cells apoptosis.

KEY WORDS:chemokine CXCL10; islets of Langerhans/cytology; Toll-like receptor 4; diabetes mellitus

作者简介:杨立勇(1957-)，男，主任医师，教授，医学博士. Email: yly_lm@sina.com

基金项目:国家自然科学基金(81370912)

收稿日期:2014-09-24

中图分类号:R329.24； R392.12； R587.1

文献标志码:A

文章编号:1672-4194(2015)01-0007-04

作者单位: 福建医科大学 附属第一医院内分泌科，福州350005