不同立地条件下不同竹林土壤微生物特性1)

许秀兰 杨春琳 刘应高 夏海洋 白燕

(四川农业大学，雅安，625014) (重庆姜家镇派出所) (四川富顺林业局)

不同立地条件下不同竹林土壤微生物特性1)

许秀兰 杨春琳 刘应高 夏海洋 白燕

(四川农业大学，雅安，625014) (重庆姜家镇派出所) (四川富顺林业局)

采用平板稀释法对不同立地条件的3种竹林土壤微生物进行分离，并结合PCR-DGGE技术，对土壤细菌的多样性进行分析。测定土壤理化性质和微生物量碳，对土壤微生物特征与土壤养分之间的关系进行相关性分析。结果显示，3个样地土壤细菌数量在3种竹林土壤微生物区系中达90%以上，均占据绝对优势。宜宾地区微生物数量和细菌多样性最高，泸州的梁山慈竹最低。3个地区竹林微生物量碳在秋冬季均显著高于春夏季，与植物的生长状况息息相关。相关性分析表明，土壤中3大微生物数量和细菌多样性均与土壤有机质之间呈显著正相关，其中土壤细菌与土壤有机质、碱解氮含量之间关系最为密切，说明土壤微生物对土壤肥力有一定的指示作用。

竹林土壤；土壤微生物；微生物量碳；细菌多样性

We isolated the soil microorganisms with dilution flat plate counting method, and measured the diversity of preponderant group of bacteria using PCR-DGGE technology. We also measured the characteristics of soil and soil microbial biomass carbon, and analyzed correlation between the microorganisms and soil properties. The bacteria had an absolute advantage in the soil microbiota, and the diversity of soil bacteria in different bamboo ecosystem wereP.heterocycla>B.pervariabilis×D.grandis>D.farinosus. The microbial biomass carbon in autumn and winter was significantly higher than that in spring and summer, which showed a closely relation with the growth of plants. By correlation analysis, three groups of the soil microorganisms and bacterial diversity were positive correlated with the soil organic matter. Moreover, the bacterial diversity had positive correlation or significantly positive correlation with the organic matter and alkaline hydrolysis nitrogen in the soil. Soil microbial could be regarded as an indicator to reflect the soil fertility with has great application potential.

土壤微生物在土壤生态系统物质循环和能量流动中发挥着决定性作用，目前常以土壤微生物结构与功能的多样性等方面的研究作为评价退化生态系统中生物群系与恢复功能之间的关系[1]。土壤微生物主要分布在0～20 cm的土层中，随着土层的加深微生物数量迅速减少，并在季节分布上表现出差异性[2]。目前关注较多的是植被类型或植物不同品种与土壤微生物群落结构及其多样性的关系[3-4]。研究土壤微生物群落与植被多样性之间的相互影响对于揭示微生物、环境和植物之间的关系意义重大。黄元元等[5]研究不同演替阶段植被类型土壤微生物群落特征时指出，植被主要通过土壤全磷和有机质影响微生物代谢功能多样性。

梁山慈竹(Dendrocalamusfarinosus)和撑×绿杂交竹(Bambusapervariabilis×Dendrocalamopsisgrandis)是重要的丛生型笋材两用经济竹种，毛竹(Phyllostachysheterocycla)则为重要的散生型两用经济竹种。其中梁山慈为四川南部重要的乡土竹种之一，而撑×绿杂交竹则为多年育种培育出来的杂交新品种，毛竹是南方最主要的经济竹种。因3竹种在生长和材质上的优点而成为了四川地区主要的竹林组成种。本研究选择的试验对象为四川地区的3种优势竹种，对其四季的土壤微生物组成以及微生物量碳等方面进行了研究，旨在掌握竹林土壤微生物的分布特征，为竹林经营和管理提供科学的基础。

1 试验地概况

试验采样地位于四川省梁山慈竹采自泸州市叙永县水尾镇(N28°10′～28°28′，E105°28′～105°48′)。该地区气候温暖湿润，年均温度约18 ℃，年无霜期300 d以上，土壤类型为紫色土。撑×绿杂交竹设在雅安市陇西乡(N30°2′～30°3′；E103°0′～103°2′)，年均气温约15 ℃，年无霜期300 d以上，林地土壤为紫色土。毛竹采自宜宾市蜀南竹海(N28°29′～28°30′；E105°3′～105°4′)，该地区年均气温在16 ℃，年无霜期300 d以上，土壤类型为黄壤土。其他样地情况见表1。

表1 样地基本情况

注：表中数据为平均值±标准差。

2 研究方法

2.1 样品采集

采样时间以1 a为周期，分别在1、5、8和11月进行4次采样。在每个研究区设置3个10 m×10 m样地，按S形布点取10个样点，采取0～30 cm土层混合均匀后装入无菌聚乙烯袋(鲜土样约500 g)，贴上标签并使用冰袋保存，尽快带回实验室分析测定。无菌条件下，挑除小石块与可见根系，过2 mm筛。过筛土样均分3份，一份风干后研磨、过筛以测定土壤理化性质；另一份放于无菌塑料袋于冰箱中4 ℃保存，用于土壤微生物的分离和微生物量测定；最后一份土样存于冰箱中-20 ℃保存，用于土壤总DNA分析。

2.2 土壤基本理化性质测定

土壤理化性质的测定参考森林土壤分析方法(中华人民共和国林业行业标准LY/T1213～1239—1999)[6]。

测定指标：土壤含水量(烘干法)、土壤pH值(电位法)、土壤有机质(重铬酸钾法氧化法—外加热法)、土壤全氮(半微量凯氏定氮法)、土壤碱解氮(碱解—扩散法)、土壤速效钾(乙酸铵浸提—火焰光度法)、土壤有效磷(乙酸铵浸提—原子分光光度计法)。

2.3 土壤微生物数量测定

土壤微生物量的测定采用稀释平板法[7]。秤取10 g新鲜土样，加入含有90 mL无菌水的250 mL三角瓶中(内附玻璃珠)，振荡15 min后静置30 s使土样均匀分散，此为菌悬液原液。按10倍稀释法将原液分别制备成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍数的土壤悬液。由于土壤中不同的微生物类群的含量差异，细菌分离时采用悬浮液质量分数范围为10-3～10-5，真菌采用10-1～10-3，放线菌为10-2～10-4。吸取100 μL土壤悬液分别涂布于真菌、细菌和放线菌分离培养基，每个浓度重复3次。细菌培养温度为37 ℃，培养2～3 d，真菌培养温度为25 ℃，培养3～5 d，放线菌培养温度为30 ℃，培养5～7 d。培养一定时间后，计算培养皿上出现的菌落个数。

土壤中微生物密度=平均每皿菌落数×稀释倍数/干土质量。

2.4 土壤微生物量碳测定

土壤微生物量碳(MBC)的测定采用熏蒸-浸提法，具体操作见参考文献[8]。

(1)

土壤微生物量碳质量分数=2.64×EC。

(2)

式中：V0为滴定空白所消耗的FeSO4溶液体积(mL)；V为滴定土壤浸提液消耗的FeSO4溶液体积(mL)；M为FeSO4溶液的浓度(moL·L-1)；f为稀释倍数；W为烘干土质量(g)；EC为不熏蒸与熏蒸土壤有机碳的差值。

2.5 土壤细菌多样性分析

2.5.1 土壤总DNA的提取和扩增

土壤总DNA的提取按照Hu[9]的方法进行。将土壤总DNA溶液用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，并采用上海生工的UNIQ-10柱式胶纯化试剂盒对DNA进行纯化。细菌的PCR扩增采用的是16SrDNA基因中的V3区特异引物518 r(5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’)和341f(5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’)。扩增条件设置：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性50 s，54 ℃退火50 s，72 ℃延伸70 s，共30个循环；最后于72 ℃延伸10 min。

2.5.2 变性梯度凝胶电泳(DGGE)及图谱分析

DGGE的操作步骤：每孔的上样量为25 μL(20 μL PCR产物+5 μL上样缓冲液)，先50 V电压进行预电泳30 min，再用160 V电泳330 min，电泳结束10 min后，将玻璃板取出染色。用10%的乙酸溶液固定10 min，使用去离子水漂洗3次，再置于振荡器上用0.2%的硝酸银溶液染色20 min，并快速用去离子水洗涤5～10 s，接着使用2.5%的无水碳酸钠溶液显影，最后用10%的乙酸溶液终止反应。DGGE指纹图谱用Bio-Rad公司的凝胶成像系统进行成像。

图谱分析：观察各土壤样品中的PCR产物经变性凝胶电泳分离后得到的电泳图谱，使用Quantity One分析软件(Bio-Rad)对各样品的电泳条带的多少及其密度进行多样性分析。计算土壤样品中的细菌多样性指数(H)和丰度(S)。

H=-∑PilnPi。

(3)

式中：Pi为某个样品单一条带的强度在该样品中的所以条带总强度中所占的比率；S为某个样品中所有条带数目总和。

2.6 数据处理

试验所得数据借助Excel 2007和SPSS 20.0统计软件进行相关处理，采用LSD法对数据间进行差异显著性检验及相关性分析，借用origin 8.5作图。

3 结果与分析

3.1 土壤微生物的组成

土壤微生物是土壤生态系统的基本组成部分，微生物群落结构的组成和数量是维持土壤健康的重要因素。细菌、真菌和放线菌是土壤微生物的3大类群，在土壤养分的循环和矿物分解中发挥着积极的作用[10]。在3个样地的竹林土壤中(表2)，细菌数量最多，占土壤微生物总量的91.24%～92.81%，居于主导地位。放线菌所占比例次之，为6.61%～8.05%。而真菌的数量最少，仅为微生物总量的0.53%～0.70%。土壤中3大微生物的数量均表现出明显的季节性动态(表2)，细菌和放线菌在夏季数量达到最大值，冬季则最小。而土壤真菌同样在夏季达到最高值，但在冬季出现小幅提升的趋势。此外，比较3竹种土壤微生物可以看出，宜宾的毛竹土壤细菌以及放线菌数量最高，而雅安的撑×绿杂交竹的真菌则表现出最高。泸州的梁山慈竹土壤中3大类群微生物数量均最低。

表2 不同竹林土壤微生物数量

注：表中数据为平均值±标准差。

3.2 土壤细菌的多样性指数分析

微生物多样性变化是表征土壤质量状况的敏感指标。通过分析电泳图谱(图1)，可以直观地判断每个土壤样品中细菌种群数量的多少，相比传统的微生物分离鉴定节约大量时间。3种竹林下土壤细菌呈现出明显的季节动态，但是变化趋势有差异，但不难看出宜宾毛竹土壤细菌数量在整体上高于其余两种竹种。毛竹林四个季节土壤细菌多样性指数(H)由大到小为：夏季、秋季、春、冬季；泸州梁山慈竹秋季多样性指数为大于夏季的、冬季多样性指数春季的；雅安撑×绿杂交竹则表现出夏季、冬季、秋季>春季，3种竹林下土壤细菌均在夏秋季节相对更高。而3种竹林土壤细菌丰度为毛竹(36)>撑×绿杂交竹(24)>梁山慈竹(16)(表3)。

泳道1～4分别为春季、夏季、秋季和冬季土壤样品。

3.3 土壤微生物量碳(MBC)的动态变化

3种竹林土壤微生物量碳随着时间的变化均呈现出先降低后升高的趋势(表4)，即毛竹、梁山慈竹和撑×绿杂交竹下的土壤微生物碳在夏季出现一个低谷，秋冬季节又逐渐上升。春夏季竹林土壤微生物量碳极显著低于秋冬季节(P<0.01)。其中宜宾毛竹林下土壤的微生物碳量相对高于其他两竹种，且四季之间的变化差异明显。

表3 3竹林土壤样品DGGE电泳条带丰度及多样性指数

注：表中数据为平均值±标准差；同列不同字母表示同一竹种不同季节的土壤细菌多样性及丰度在0.05水平上差异显著。

表4 不同季节土壤微生物量碳质量分数 mg·g-1

注：表中数据为平均值±标准差。

3.4 土壤微生物特征与土壤养分的相关性

如表5所示，土壤微生物特征与土壤养分之间表现出一定的相关性。在土壤3大微生物类群中，真菌和细菌的数量与土壤养分之间的相关性密切。土壤有机质和土壤细菌、土壤真菌、土壤放线菌数量及细菌多样性指数之间表现出显著正相关(P<0.05)。有机质表征着土壤肥力，他们之间的相关性可说明土壤的肥力影响着土壤微生物的活动，或者可以说是土壤微生物的代谢活动为土壤肥力的保持提供了保障。其次，3种竹林土壤中的细菌和碱解氮之间还表现为极显著正相关(P<0.01)或者显著正相关，而其他特征之间的相关性不明显。此外，3种竹林土壤生态系统中的微生物量碳与土壤养分之间的相关性并不明显。

表5 土壤微生物特征与土壤养分之间的相关性

注：*为在0.05水平显著相关，** 为在0.01水平极显著相关。

4 结论与讨论

土壤是微生物的天然培养基，细菌、真菌和放线菌3大类群微生物积极参与土壤养分的循环，表征着土壤的生物活性。细菌在土壤无机物和有机物的转化过程中起着重要作用；真菌主要参与有机质的分解，可将枯落物中的蛋白质分解成植物可吸收利用的可溶性N、氨基酸和铵盐等小分子物质；放线菌也可参与一些较难分解的植物或者动物组分，形成腐殖质并转化为土壤中的有机成分[11]。3种竹林生态系统中，均表现出细菌数量的绝对优势[10]和细菌的多样性[12]，且在宜宾毛竹土壤中，细菌、放线菌的数量和细菌多样性。此外，微生物量碳均也高于其他两地的两竹种。这样的优势与多样性对土壤养分有效化和促进植物生长起着重要作用。土壤微生物的分布与土壤养分息息相关，用土壤微生物相关指标来反映土壤肥力具有较大的应用潜力[13-14]。土壤养分为微生物提供能量来源的同时也要依靠土壤微生物的转化而得到实时补充，所以微生物和土壤质量之间存在复杂的相互作用。张瑞等[15]研究得出，有机肥的添加有利于土壤微生物代谢活性和微生物群落功能的多样性。本试验相关分析表明，细菌数量与土壤有机质和碱解氮含量之间的相关性最为密切，其次为真菌。可见，土壤中的细菌对土壤养分变化较为敏感，细菌群落的变化影响土壤养分的转化以及植物的生长。

土壤微生物群落特征与森林群落、土壤类型、可利用营养成分以及pH值等有着直接联系[16]。土壤微生物量可反映参与调控土壤中能量和养分循环以及有机物质转化的微生物数量[17]。3种竹林土壤中，在秋冬季节的微生物量碳处于相对较高的水平，这与朴春河和王国兵等[18-19]人的研究结果一致，均表现为植物生长旺盛时期土壤微生物量低，休眠时期则升高。此外，黄靖宇等研究发现植物根系对土壤中碳、氮的吸收与微生物对碳、氮的需求是一种竞争的关系，植物对土壤中碳、氮的需求越大，土壤微生物量碳、氮的值就越小[20]。在3种竹林生态系统中，微生物量碳和土壤微生物数量几乎表现出相反的变化趋势。在春、夏季节，竹子生长旺盛，土壤养分多供植物生长所需，在营养竞争中微生物处于劣势；同时，夏季干湿的土壤环境加快土壤微生物量向可溶性有机碳的转换，并不断消耗微生物量碳而使其降低[18]，秋冬季节则相反。然而，土壤微生物生物量碳的变化规律及其调控机制还需深入研究。

传统的微生物培养方法只能对可培养微生物进行研究，PCR-DGGE技术的发展可以更全面的反映土壤微生物群落的真实信息。在土壤生态系统中，蕴含着丰富的微生物资源，对竹林土壤中的微生物资源进行系统的研究，不仅有利于对植物生长的土壤环境进行较多的微观了解，更有助于土壤微生物资源的开发利用。

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Characteristics of Soil Microorganisms in Three Bamboo Ecosystems

Xu Xiulan, Yang Chunlin, Liu Yinggao(Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, P. R. China); Xia Haiyang(Jiangjia Police Station of Banan District); Bai Yan(County Forestry Bureau)/Journal of Northeast Forestry University，2015,43(2)：51-54，58.

Bamboo forest soil; Soil microorganism; Microbial biomass carbon; Bacterial diversity

1) 国家科技支撑计划项目(2008BADC2B01)。

许秀兰，女，1986年1月生，四川农业大学林学院，博士研究生。E-mail:xuxiulanxxl@126.com。

刘应高，四川农业大学林学院，教授。E-mail:lyg927@263.net。

2014年7月1日。

S154.3

责任编辑：潘 华。