尤瑞克林对缺血再灌注大鼠脑神经生长因子表达的影响

李国前，王杰华，杨小霞，潘 莹，陈淑增，许秀秀

神经生长因子(nerve growth factor，NGF)是一种具有神经元营养和促突起生长双重生物学功能的神经细胞生长调节因子，对中枢神经系统的再生和修复有着重要的作用［1，2］，探索NGF 的表达机制对于治疗神经损伤具有重要意义。尤瑞克林是近年研制的国家一类新药，对急性脑血管病具有显著的治疗作用［3］，目前作用机制未完全明确。本实验探讨尤瑞克林对大鼠脑缺血再灌注损伤后大脑皮质NGF 表达的影响。

1 材料和方法

1.1 材料 成年雄性SD 大鼠24 只，体重250～300 g，福建医科大学实验动物中心提供。注射用尤瑞克林(0.15 PNA 单位/瓶)，广东天普生化医药股份有限公司;Trizol 试剂，美国Invitrogen 公司;逆转录试剂盒及PCR 试剂盒，加拿大MBI Fermentas公司;兔抗大鼠NGF 抗体，武汉博士德生物工程有限公司;即用型免疫组化试剂盒(鼠/兔)，福州迈新生物技术开发有限公司;β-actin 和辣根酶标记IgG，北京中杉金桥生物技术有限公司;Beyo ECL，Western 荧光检测试剂，中国碧云天生物技术公司。

1.2 动物分组与给药 实验大鼠随机分为3组:假手术组(sham 组)、模型组(model 组)和实验组(test 组)，每组8 只。实验组于再灌注后5 min 静脉注射用灭菌生理氯化钠溶液稀释的尤瑞克林3.5×10-3PNAU/kg，给药体积1 ml/kg。假手术组和模型组正常喂养。

1.3 模型制备 模型组和实验组参考改良Zea-Longa 线栓法［4］制备大鼠大脑中动脉栓塞模型。血流阻断2 h 后拔出线栓，形成再灌注。假手术组大鼠接受相似手术处理，但是不插入线栓。再灌注48 h 后处死动物断头取脑，取右侧大脑半球视交叉后6～11 mm 的缺血侧脑组织皮质区备用。

1.4 半定量PCR 法检测NGF mRNA 的表达NGF 上游引物为:5’-tccacccacccagtcttcca-3’，下游引物为:5’-gccttcctgctgagcacaca-3’(扩增产物344 bp);β-actin 上游引物为:5’-attgtaaccaactgggacg-3’，下游引物为:5’-tctccagggaggaagagg-3’(扩增产物490 bp)。取缺血侧脑组织按Trizol 法提取总RNA并进行逆转录反应。PCR 扩增反应条件为:变性94 ℃30 s，退火64 ℃30 s，延伸72 ℃30 s，反应循环数为34。反应完毕后扩增产物进行电泳，半定量分析电泳条带的吸光度，结果以目的基因与β-actin吸光度的比值表示。

1.5 免疫组织化学法检测NGF 的表达 大鼠脑组织切片经脱腊至水，室温孵育5～10 min，高压修复2～5 min;加入一抗兔抗大鼠NGF 抗体(工作浓度约为1∶ 100)，4 ℃湿盒孵育过夜;再加入滴加生物素化小鼠抗兔的二抗，室温30 min，AEC 显色10～20 min(显微镜下控制显色程度);自来水充分冲洗，终止反应，苏木素复染;滴加水性封片剂，干燥后中性树胶封片。各步骤间用0.01 mol/L PBS 冲洗。阳性细胞计数:在400 倍光学显微镜下分别随机选取5 个视野，分别计数免疫反应阳性的细胞数。

1.6 Western blot 法检测NGF 蛋白的表达取缺血侧脑组织100 mg 置于玻璃匀浆器中，加入裂解液，严格按照说明书进行蛋白提取，然后采用BCA法测定蛋白浓度。取25 μg 蛋白，变性后垂直电泳，电转至PVDF 膜，用含10%脱脂奶粉的TBS 室温封闭2 h，分别加入一抗(兔抗大鼠NGF 抗体，1∶ 1000;兔抗大鼠β-actin 抗体，1∶ 1000)，4 ℃孵育过夜，用含0.1% Tween-20 的TBS 洗涤3 次，然后与辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(1∶ 2000)室温孵育1 h，重复洗涤3 次，最后用ECL 液显色，X 片显影、定影。采用Image J 图像分析测定Western blot 条带灰度值，结果以NGF 与β-actin 灰度值的比值表示。

1.7 数据统计学分析 采用SPSS 17.0 统计软件进行单因素方差分析，结果用均数±标准差()表示，P ＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠NGF mRNA 的表达变化 假手术组NGF mRNA 有微弱的表达(0.11 ±0.03)。模型组NGF mRNA 表达较假手术组显著增高(0.32 ±0.05)，差异有统计学意义(P ＜0.05)。实验组NGF mRNA 表达较模型组显著增高(0.70 ±0.08)，差异有统计学意义(P ＜0.05)(见表1、图1)。

2.2 各组大鼠NGF 阳性细胞的表达变化 假手术组仅见少量NGF 阳性细胞表达(8.42 ±1.85);模型组NGF 阳性细胞表达较假手术组显著增多(24.51±5.29)，差异有统计学意义(P ＜0.05);实验组NGF 阳性细胞表达较模型组显著增多(38.46 ±6.10)，差异有统计学意义(P ＜0.05)(见表1、图2)。

2.3 各组大鼠NGF 蛋白的表达变化 假手术组NGF 蛋白有微弱的表达(0.13 ±0.02);模型组NGF 蛋白表达较假手术组显著增多(0.34 ±0.06)，差异有统计学意义(P ＜0.05);实验组NGF 蛋白表达较模型组显著增多(0.45 ±0.08)，差异有统计学意义(P ＜0.05)(见表1、图3)。

表1 各组大鼠NGF 表达的比较(n=8，)

表1 各组大鼠NGF 表达的比较(n=8，)

与假手术组比较* P ＜0.05;与模型组比较#P ＜0.05

图1 各组大鼠缺血区脑组织NGF mRNA 的表达

图2 各组大鼠缺血区脑组织NGF 阳性细胞的表达(×400)

图3 各组大鼠缺血区脑组织NGF 蛋白的表达

3 讨论

NGF 是神经系统最主要的神经营养因子，与其高亲和性膜受体TrkA 结合后，经胞内的一系列信号转导途径，在神经元的发育、轴突的生长、递质的合成以及细胞的凋亡等各个阶段均发挥着重要的作用［5］;同时参与了调节交感、感觉神经元的分化和成熟的过程，具有促进神经元的生存，调节突触效力和可塑性的作用［6，7］。有许多研究表明，脑缺血再灌注损伤后具有自我修复的潜力，且其修复与非神经元区的神经再生以及NGF 的表达有着密切的关系［8，9］。NGF 的分子量很大难以透入血脑屏障，直接给予外源性NGF 治疗脑缺血损伤难以凑效;而内源性NGF 在脑缺血损伤发生时维持时间短，而且表达水平有限，难以对受损神经元起到全面、持久的保护作用。因此给药途径和药物合成是今后研究的重点所在。本实验通过建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型，结果发现，脑缺血再灌注损伤后，模型组大鼠大脑皮质NGF 表达较假手术组升高，提示机体可促进NGF 的应激性表达上调，改善神经元的病理状态，减轻神经损害［10］。

尤瑞克林是人尿激肽原酶，是激肽原酶-激肽系统中的重要组成部分。激肽原酶作用于激肽原，使其释放出激肽，激肽与激肽受体结合，从而产生一系列的生理作用［11］。基础研究表明，脑组织缺血损伤后，整个激肽原酶-激肽系统，包括激肽原酶、激肽均会一过性地升高，激肽受体表达也上调，表明激肽原酶-激肽系统参与脑缺血病理生理过程［12］。药效学研究显示尤瑞克林可明显提高缺血脑组织的血管储备功能，增加局部血流灌注量，改善脑微循环;促进损伤部位新生血管生成、抑制细胞凋亡;增加红细胞变形能力和氧解离能力;抑制血小板聚集和血液凝固，从而改善脑梗死患者的预后［13］。在脑缺血动物模型的研究中发现:侧脑室转尤瑞克林能够减小梗死体积、减少细胞凋亡、减弱氧化应激反应、增加细胞的存活和迁移;缺血后应用外源性尤瑞克林可以增加缺血组织血管新生和神经再生［11］。本实验对大鼠脑缺血再灌注损伤后予尤瑞克林进行干预，结果发现，实验组大鼠大脑皮质NGF 表达较模型组进一步升高，证实尤瑞克林对改善NGF 的表达有较好的作用，从而对神经元的功能具有较好的保护作用。

［1］詹合琴，李生莹，李平法，等.Lactuside B 对脑缺血再灌注损伤后大鼠海马和纹状体神经生长因子mRNA 表达的影响［J］.中国老年学杂志，2013，33(3):592 -594.

［2］Luk YO，Chen WY，Wong WJ，et al.Treatment of focal cerebral ischemia with liposomal nerve growth factor［J］.Drug Deliv，2004，11(5):319 -324.

［3］Emanueli C，Madeddu P.Angiogenesis therapy with human tissue kallikrein for the treatment of ischemic disease［J］.Arch Mal Coeur，2004，97(6):679 -687.

［4］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20(1):84 -91.

［5］Prakash N，Cohen-Cory S，Penschuck S，et al.Basal forebrain cholinergic system is involved in rapid nerve growth factor(NGF)-induced plasticity in the barrel cortex of adult rats［J］.Neurophysiol，2004，91:424 -437.

［6］Guo L，Yeh ML，Cuzon Carlson VC，et al.Nerve growth factor in the hippocamposeptal system:evidence for activity-dependent anterograde delivery and modulation of synaptic activity［J］.Neurosci，2012，32:7701 -7710.

［7］李倩，黄希艳，朱陵群.片仔癀对局灶性脑梗死大鼠神经生长因子表达的影响［J］.神经解剖学杂志，2012，28(5):464 -468.

［8］Parent JM，Vexler ZS，Gong C，et al.Rat forebrain neurogenesis and striatal neuron replacement after focal stroke［J］.Ann Neurol，2002，52:802 -813.

［9］Wang YQ，Guo X，Qiu MH，et al.VEGF overexpression enhances striatal neurogenesis in brain of adult rat after a transient middle cerebral artery occlusion［J］.Neurosci Res，2006，88(1):73 -82.

［10］Tang XQ，Cai J，Nelson KD，et al.Functional repair after dorsal rootrhizotomy using nerve conduits and neurotrophic molecules［J］.Eur J Neurosci，2004，20(5):1211 -1218.

［11］梁中奎.尤瑞克林治疗进展性卒中30 例［J］.中国实用医刊，2011，38(19):80 -81.

［12］赵晓霞，胡风云.尤瑞克林对大鼠神经细胞凋亡的影响［J］.中国实用医刊，2013，40(1):1 -4.

［13］姚明星，马玉英.尤瑞克林治疗脑梗死研究进展［J］.医药导报，2010，29(5):637 -639.