小白菊内酯对帕金森病MPTP 模型小鼠抗炎作用的研究

张 辉，陶建峰，王爱军，孙 娜，王 茜

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种中枢神经系统变性疾病，病因及发病机制至今未明。有研究显示炎症反应与PD 发病密切相关［1，2］。环氧合酶-2(Cyclooxygenase-2，COX-2)与前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)作为炎症反应的重要生物学指标［3］，有研究显示其介导的炎症反应可能参与PD 发病过程［4］。同时有报道PD 患者中脑黑质区存在诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide，iNOS)的高度活化，iNOS 在PD 发病中与炎症关系密切，且可能起重要作用［5］。小白菊内酯作为艾菊的有效成分，具有抗氧化、抗炎、提高免疫力等作用［6，7］。有文献报道，小白菊内酯对MPTP 致黑质区多巴胺(DA)能神经元的损伤具有一定的保护作用［8］。那么小白菊内酯是否可通过影响炎症反应从而保护DA 能神经元，为明确此问题，本研究观察小白菊内酯干预后小鼠黑质COX-2、PGE2、iNOS 表达变化的过程，探讨小白菊内酯的抗炎作用及对DA 能神经元的保护作用机制。

1 材料和方法

1.1 试剂MPTP(Sigma USA) 兔抗人COX-2单克隆抗体(福州迈新生物)，兔抗人PGE2 单克隆抗体(Cayman USA)，兔抗小鼠iNOS 单克隆抗体(福州迈新生物)，小鼠抗人TH 单克隆抗体(Chemicon USA)，UltraSensitive TMSP 超敏试剂盒(福州迈新生物)，预染蛋白Marker(天津灏洋生物公司)，小白菊内酯(Sigma 公司)。

1.2 实验动物 健康雄性小鼠C57BL6 小鼠45 只，8～12 周龄，体质量25～30 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司［SCXX(京)2002-0003］，自由进食饮水，室温(25 ±2)℃，单笼喂养，自然光照。

1.3 方法

1.3.1 动物分组和模型制备 健康雄性C57BL6 随机分为3 组，每组15 只。模型组:给予MPTP(30 mg/kg，盐水溶，腹腔注射)，1 次/d，连续5 d。小白菊内酯干预组:除给予PD 组相同的MPTP 处理外，MPTP 注射前2 h 注射小白菊内酯(5 mg/kg，DMSO 溶，腹腔注射)，之后注射MPTP(30 mg/kg，盐水溶，腹腔注射)，1 次/d，连续5 d。对照组:注射与PD 组和干预组等体积的盐水。3 组小鼠均于MPTP 第5 次注射后24 h 处死。

1.3.2 标本采集 免疫组化:每组选择9 只小鼠麻醉后，行40 g/L 多聚甲醛磷酸盐缓冲液常规灌注固定，迅速开颅取脑，40 g/L 多聚甲醛后固定48 h(4 ℃)，石蜡包埋切片。Western blot:每组选择6 只小鼠麻醉后取脑，分离中脑黑质部分，置入细胞裂解液中，低温匀浆，4 ℃震荡30 min 后，12000 转4 ℃离心15 min，取上清，-80 ℃保存备用。

1.3.3 免疫组织化学检测 脑组织切片常规脱蜡至水，后用TBST(pH7.4 ±0.2)洗涤;组织抗原行水浴法热修复;3%过氧化氢阻断内源过氧化物酶，正常非免疫动物血清室温孵育10 min;同一组织相邻切片分别加入一抗即兔抗人COX-2 单克隆抗体(1∶ 100)、兔抗人PGE2 单克隆抗体(1∶ 300)、兔抗小鼠iNOS 单克隆抗体(1∶ 100)、小鼠抗人TH单克隆抗体(1∶ 400)，4 ℃过夜;TBST 洗涤后，加入生物素标记二抗(1∶ 150)室温孵育;TBST 洗涤，加入链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶室温孵育20 min，DAB 显色，中性树胶封固，光镜下观察照相。

1.3.4 Western blot 取标本蛋白定量后加入4 倍体积样本缓冲液，95 ℃变性5 min。取20 μg 样品在100 g/L 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)上电泳后，电转至硝酸纤维素膜，以标准蛋白Marker 为参照，依分子质量大小切取条带，取相应条带分别加入COX-2 一抗(1∶ 400)、PGE2一抗(1∶ 600)、iNOS 一抗(1∶ 400)和TH 一抗(1∶ 1000)，4 ℃过夜，TBST 冲洗后，分别与生物素标记的羊抗兔/小鼠IgG 抗血清(1∶ 200)室温震荡孵育2 h，TBST 洗涤后，与卵白素-辣根过氧化物酶复合物室温下孵育0.5 h，DAB 显色。将特异性蛋白条带扫描后，在同一条件下应用CMIAS 真彩医学图像分析系统测定条带平均光密度值。

1.4 统计学处理 选定黑质所在区域，采用CMIAS 真彩色医学图像免疫组化自动分析系统进行阳性细胞计数。各组每只动物的3 张脑片数值相加后取平均值，实验结果使用SPSS 13.0 统计软件进行统计处理。分别采用单因素方差分析，q 检验，P ＜0.05 表示差异有统计学意义，以P ＜0.01 表示差异有显著性。Western blot 数据统计分析同上。

2 结果

2.1 PD 模型复制成功 模型小鼠于第一次注药后10～20 min 均出现不同程度的震颤、竖毛、翘尾，MPTP 最后一次注射后，模型小鼠出现步态蹒跚、活动减少、动作变慢等症状;对照组未出现上述行为学变化;小白菊内酯干预组与模型组比较上述行为学症状明显减轻。

2.2 免疫组化检测结果 对照组中脑黑质致密部可见大量TH 阳性神经元，且排列整齐，呈条带状，偶见COX-2、PGE2、iNOS 阳性细胞散在分布。模型组与对照组相比，TH 阳性细胞显著减少约58%，黑质区可见大量COX-2、PGE2、iNOS 阳性细胞。干预组TH 阳性神经元的丢失较模型组明显为轻，仅较对照组减少约27%，且黑质区COX-2、PGE2、iNOS 阳性细胞较模型组有显著减少。干预组与对照组相比炎症因子COX-2、PGE2、iNOS 表达增多不明显。图像分析结果显示，模型组、干预组、对照组差异有统计学意义(P ＜0.01，见表1)。

2.3 Western blot 检测结果 在预染蛋白标准约Mr 2000、72000、130000 和61000 处，分别可见PGE2、COX-2、iNOS 和TH 特异性蛋白条带。图像分析发现，模型组COX-2、PGE2、iNOS 的表达均明显增高，TH 表达显著降低，与对照组比较，光密度差异均有统计学意义(P ＜0.05，见表2);小白菊内酯干预组与模型组比较，COX-2、PGE2、iNOS 的表达均显著降低，TH 表达降低程度减轻，差异有统计学意义(P ＜0.05，见表2);对照组仅有少量COX-2、PGE2、iNOS 的表达，干预组与对照组相比COX-2、PGE2、iNOS 表达增多不明显。

表1 小白菊内酯干预组对黑质区COX-2、PGE2、iNOS 表达和TH 阳性细胞数的影响(n=9，)

与对照组比较* P ＜0.05;与模型组比较#P ＜0.05

表2 各组小鼠中脑黑质TH、COX-2、PGE2 和iNOS 蛋白表达水平(n=6，)

表2 各组小鼠中脑黑质TH、COX-2、PGE2 和iNOS 蛋白表达水平(n=6，)

与对照组比较* P ＜0.05;与模型组比较#P ＜0.05

3 讨论

PD 主要病理特征为中脑黑质DA 能神经元进行变性缺失，其临床表现有静止性震颤、运动迟缓和姿势步态异常等。本实验复制的PD 模型小鼠具有典型的行为学表现;实验结果显示中脑黑质致密部TH 免疫阳性细胞明显减少，中脑黑质TH 蛋白表达下降，这提示本实验动物中脑黑质存在DA 能神经元大量丢失，上述结果说明，本实验PD 模型复制成功［9］。

有研究发现，PD 患者黑质致密部DA 能神经元大量丢失，伴有小胶质细胞活化增生和致炎性因子高表达［10］;模型动物中脑黑质纹状体系统存在PGE2、iNOS、TNF-α 等炎症因子高表达，且炎性因子表达量与DA 能神经元数量存在负相关关系;抗炎性药物可显著减少PD 模型动物胶质细胞增生、致炎性因子表达和DA 能神经元丢失［11］。这提示，炎症反应可能在PD 发病中起重要作用。同时iNOS 作为炎症的反应性酶类，其表达与神经元损伤。本室前期研究也表明，炎症介质PGE2 的关键限速酶COX-2以及炎症因子iNOS 在MPTP 所致PD 动物模型DA能神经元丢失过程中发挥重要作用［4］。为证实MPTP 模型中炎症反应与DA 能神经元变性丢失的关系，本实验检测了COX-2、PGE2 和iNOS 在小鼠模型中脑黑质中的表达情况，结果发现在小鼠模型建立成功之后，COX-2、PGE2 和iNOS 阳性细胞显著增多，同时伴有TH 阳性细胞的显著减少，提示COX-2及iNOS 介导的炎症反应的加剧有可能参与造成黑质区DA 能神经元大量变性缺失。

有文献报道，小白菊内酯具有抗炎、抗氧化等功能，并对MPTP 致黑质区DA 能神经元的损伤具有一定的保护作用［6，7］。本研究观察小白菊内酯干预后小鼠黑质COX-2、PGE2 和iNOS 阳性细胞及蛋白水平较模型组有明显减少，相应的黑质区TH 阳性细胞和蛋白水平较模型组降低程度减轻。这提示小白菊内酯可在一定程度上影响COX-2、PGE2 和iNOS 表达，从而减轻黑质区的炎症反应，使黑质DA 能神经元免于MPTP 诱导的损伤，对DA 神经元起到一定保护作用，最终使该模型小鼠运动功能障碍得以改善。

本研究表明，COX-2 和iNOS 导致的炎症反应可能参与造成PD 病DA 能神经元的变性缺失;小白菊内酯可通过影响COX-2、PGE2 和iNOS 的表达，起到抗炎作用进而对小鼠多巴胺能神经元起到一定的保护作用。

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