观察肢体缺血后处理对急性脑梗死大鼠血脑屏障的保护效应及其机制的探讨

陈 历，石秋艳，张春阳，孙 原，李艳玲，杨 斌

近年来，随着缺血预适应方法的研究深入，发现由于疾病的不可预测性，缺血预适应难以应用在临床［1］。近几年研究表明，肢体缺血后处理对脑梗死也有保护作用。通过无创性的短暂缺血过程，诱导组织产生内源性的保护机制，能够减轻缺血再灌注损伤，为人们对缺血防治的认识开辟了新的领域，如何启动、激活这种内源性保护的研究具有积极的现实和理论意义。本实验旨在探讨肢体缺血后处理对大鼠急性脑梗死后血脑屏障的保护效应及其机制，从而为临床应用提供理论研究和实验基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物与分组 SD 雄性大鼠196 只，体重200～250 g，来源于中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究生动物实验中心［许可证号:SCXK-(军)2009-003］，恒温(26 ℃)安静环境中饲养。术前3 只一笼饲养，自由饮水进食，适应饲养环境至少7 d 后方接受实验，术后单笼饲养。术前12 h 禁食，自由饮水。实验前采用抽签法随机分为7 组，每组28 只:(1)假手术组;(2)缺血再灌注24 h 组;(3)肢体缺血后处理24 h 组;(4)缺血再灌注72 h 组;(5)肢体缺血后处理72 h 组;(6)缺血再灌注5 d 组;(7)肢体缺血后处理5 d 组。

1.2 实验主要试剂 β-淀粉样蛋白(Aβ)抗体、EphA2 鼠抗人单克隆抗体、伊文思蓝(EB)(均购于石家庄市勃盛化学试剂有限公司)。

1.3 大脑中动脉缺血模型［2］参照并改良Zea-Longa 线栓法制备大鼠右侧MCAO 模型。术后用垫料盖于大鼠身上，保持体温至清醒。术中维持肛温在37 ℃左右。大鼠术后单笼饲养，自由饮水和进食。排除标准:抽拉线栓后2 h 昏迷;Zea Longa评分0 分或者4 分;脑出血;死亡。

1.4 Zea Longa 评分标准 0 分:无明显神经缺损症状;1 分:提尾垂直时不能伸展左侧前肢;2分:行走时向左侧绕圈;3 分:行走时身体向左侧倾倒4 分;不能自行行走，意识丧失。

1.5 肢体缺血后处理方法 暴露双侧股动脉主干，在MCAO 后2 h 及以后每天同一时间用动脉夹给予夹闭2 min，开放2 min，双侧股动脉轮流进行，各5 个循环，连续5 d。假手术组和缺血再灌注组暴露股动脉(由非手术人员随机分组)。每天实验完后用庆大霉素局部消炎。

1.6 右侧脑组织含水量［3］大鼠麻醉后断头取脑，去除小脑、脑干及嗅球，电子分析天平称取脑湿重，置于70 ℃烤箱中烘72 h 称取脑干重，按公式:脑组织含水量=(湿重-干重)/湿重，计算出脑组织的含水量。

1.7 伊文思蓝的含量［4］各组在再灌注开始时即从股静脉注射2%伊文思蓝(evans blue，EB)溶液(4 ml/kg)，酶标仪法检测倍比稀释后的EB 溶液，绘制标准曲线，然后根据标准曲线求得EB 含量(μg/g 脑组织)。

1.8 免疫组化法检测EphA2 和Aβ 的表达 结果判定及计数:EphA2 和Aβ 均以胞浆及胞膜出现棕黄色颗粒视为阳性细胞，每张切片计数5 个不同400倍视野下阳性细胞数，作为各指标的阳性细胞数。

1.9 统计学方法 采用单因素方差分析，结果用均数±标准差()表示，应用SPSS 19.0 统计软件分析，P ＜0.05 认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脑组织含水量比较 与假手术组比较，再灌注和肢体缺血后处理各时间右侧脑组织含水量均较高，差异有统计学意义(P ＜0.05)。再灌注组24 h右侧脑组织含水量开始升高，72 h 达高峰，5 d出现下降;肢体缺血后处理也有相同趋势的变化，肢体缺血后处理24 h 与再灌注组同一时间略低，差异无统计学意义，72 h、5 d 肢体缺血后处理右侧脑组织含水量均低于再灌注组同一时间，差异有统计学意义(P ＜0.05)(见表1)。

2.2 右侧脑组织EB 含量比较 假手术组大鼠右侧脑组织含有少量EB，再灌注和肢体缺血后处理各时间组均比假手术组右侧脑组织EB 含量高，差异有统计学意义(P ＜0.05)。肢体缺血后处理24 h与再灌注组同一时间比较降低不明显，再灌注72 h、5 d 组右侧脑组织EB 含量明显高于肢体缺血后处理组同一时间，差异有统计学意义(P ＜0.05)(见表2)。

2.3 EphA2 表达的比较 EphA2 阳性表达为神经元胞浆及胞膜出现棕黄色颗粒。再灌注和肢体缺血后处理各时间组大鼠脑梗死周围区域的EphA2的阳性细胞数均比假手术组显著升高，且差异有统计学意义(P ＜0.05)。再灌注组24 h 组EphA2 增多，72 h 达高峰，5 d 出现下降;肢体缺血后处理变化趋势相同，与再灌注组同一时间比较，肢体缺血后处理72 h、5 d 组EphA2 的阳性细胞数均较低，差异有统计学意义(P ＜0.05)(见表3、图1)。

2.4 Aβ 表达的比较 Aβ 阳性表达为神经元胞浆及胞膜出现棕黄色颗粒。再灌注和肢体缺血后处理各时间组大鼠脑梗死周围区域的Aβ 的阳性细胞数均比假手术组显著升高，且差异有统计学意义(P ＜0.05)。再灌注组Aβ 随时间不断增多，5 d 开始下降;肢体缺血后处理变化趋势相同;肢体缺血后处理24h 组与再灌注组同一时间比较，Aβ 的阳性细胞数差异不明显(P ＞0.05);再灌注72 h、5 d 组Aβ的阳性细胞数明显高于肢体缺血后处理同时间组，差异有统计学意义(P ＜0.05)(见表4、图2)。

表1 各组不同时间点大鼠右侧脑组织含水量比较(%，，n=7)

表1 各组不同时间点大鼠右侧脑组织含水量比较(%，，n=7)

与假手术组相比较* P ＜0.05;与相应时间点再灌注组相比较#P ＜0.05

表2 各组不同时间点大鼠右侧脑组织EB 含量比较(μg/g，，n=7)

表2 各组不同时间点大鼠右侧脑组织EB 含量比较(μg/g，，n=7)

与假手术组相比较* P ＜0.05;与相应时间点再灌注组相比较#P ＜0.05

表3 各组不同时间点脑梗死周围区域EphA2 阳性细胞数比较(个/视野，，n=7)

表3 各组不同时间点脑梗死周围区域EphA2 阳性细胞数比较(个/视野，，n=7)

与假手术组相比较* P ＜0.05;与相应时间点再灌注组相比较#P ＜0.05

表4 各组大鼠大鼠脑梗死周围区域Aβ 阳性细胞数比较(个/视野，，n=7)

表4 各组大鼠大鼠脑梗死周围区域Aβ 阳性细胞数比较(个/视野，，n=7)

与假手术组相比较* P ＜0.05;与相应时间点再灌注组相比较#P ＜0.05

3 讨论

2009 年Ren 等［5］研究表明左侧股动脉实施缺血后处理能够有效地缩小大鼠脑梗死体积，并且能促进远期神经功能恢复。肢体缺血后处理通过脑缺血耐受而调动内源性保护机制，提高神经元对缺血的耐受性，延长缺血性脑血管病的治疗时间窗，为缺血性脑血管病的防治提供新的思路［6］。肢体缺血后处理可在脑缺血事件发生后实施，操作方法简单，对人体的损伤微小［7］，具有重要的临床应用价值，尤其在急性脑梗死早期实施溶栓治疗或经皮血管内介入治疗时，适时予以脑缺血后适应干预，可有效地赢得溶栓时间窗、减轻缺血再灌注损伤程度，为急性脑梗死的临床治疗提供新的策略。但是远端肢体缺血后处理的开始时间、持续时间、循环次数等因素对缺血后处理脑保护的影响，不同的研究间存在争议。Ren等研究发现缺血再灌注后实施3 个循环的缺血后处理，即刻后处理的保护效果明显优于3 h 后处理组和6 h 后处理组。CE 等［8］研究显示，肢体缺血时间累计持续40～60 min 能发挥最大的保护效应。为了进一步验证肢体缺血后处理有脑保护作用，同时增加操作可行性，本研究采用轮流夹闭双下肢股动脉主干，2 min 缺血/2 min 再灌注，各5 个周期，连续5 d。通过测量不同组别的脑含水量及EB 的通透性发现，与单纯再灌注比较，肢体缺血后处理显著地减少了大鼠脑梗死后血脑屏障通透性，从客观上证明了肢体缺血后处理对脑梗死有保护效应。

我们通过免疫组化染色观察到，假手术组有少量EphA2 表达，说明了正常机体含有少量EphA2 可能与维持正常的中枢神经功能的有关。MCAO 术后24 h，单纯再灌注和肢体缺血后处理EphA2 均明显开始升高，72 h 达高峰，5 d 开始下降;但是与再灌注组同一时间比较，肢体缺血后处理24 h 组EphA2 的阳性细胞数差异不明显，肢体缺血后处理72 h 及5 d组EphA2 的阳性细胞数均明显较低。说明了脑梗死后EphA2 表达不断增多，过多的EphA2 对机体产生毒害作用;当肢体缺血后处理累计时间未达到阈值时，产生的保护效应不明显，当达到阈值后，肢体缺血后处理的保护效应才能体现出来。与以往的研究一致［9］，脑梗死后EphA2 表达的增高导致血脑屏障通透性增高，可能是由于被大量激活的EphA2 上调EphrinA1 配体和EphrinA3 配体，通过一系列信号传递，破坏血脑屏障紧密连接的形成，增加大脑内皮细胞通透性，并且抑制神经元再生，促进细胞凋亡［10］。但是，有实验证明［11］，慢性压迫性脊髓损伤后由于缺血、缺氧引起VEGF(血管内皮生长因子)上调，可活化EphA2，从而出现血管新生及微血管改型，增加了局部血液循环，间接保护了神经细胞，保存了神经功能。EphA2 在急性缺血和慢性缺血中截然相反的作用让我们看到EphA2 作用的多样性，目前我们对它的研究还不够完善，需要我们更多的研究。

β-淀粉样蛋白增多会导致阿尔茨海默病的发生已得到公认［12～14］。但是许多研究表明，脑缺血后Aβ 也增多，主要在脑白质以及灰质缺血区周边，可有数日到数周的短暂性升高［15］。本研究发现，Aβ在MCAO 术后24 h 开始升高，72 h 达高峰，5 d 开始下降;这与EphA2、右侧脑组织含水量及EB 含量的升高趋势大致相同，可以推测Aβ 的升高与EphA2增加血脑屏障的通透性有关系，可能由于血脑屏障的通透性的增加导致了外源性Aβ 的增多，导致β淀粉样蛋白在脑内异常增多，引起了缺血再灌注损伤。而经过肢体缺血后处理，72 h 及5 d 组EphA2的阳性细胞数均明显较低。说明肢体缺血后处理能够减少对血脑屏障的通透性，从而减少了Aβ 的数量。由此还可推测，肢体缺血后处理能够通过减少Aβ，从而防治淀粉样血管病和阿尔茨海默病的发生。但是，由于本实验为动物实验，且样本量较小，尚需大样本的实验及临床研究证实。

图1 MCAO 后72 h 脑梗死周围区域EphA2 表达情况(免疫组化，×400)

图2 MCAO 后72 h 脑梗死周围区域Aβ 表达情况(免疫组化，×400)

综上所述，肢体缺血后处理能减轻大鼠急性脑梗死血脑屏障损伤的作用，脑梗死周围区EphA2 和Aβ 表达水平的降低可能为保护血脑屏障的机制。

［1］Boiten J，Lodder J.Lacunar infarction:Pathogenesis and validity of the clinical syndrome［J］.Stroke，1991，221:1374 -1378.

［2］李富强，白宏英，娄季宇，等.脑缺血后处理对缺血再灌注脑组织线粒体通透性转换的影响［J］.中风与神经疾病杂志，2011，28(9):796 -799.

［3］石秋艳，刘 超，姜进克，等.促红细胞生成素对脑出血大鼠脑水肿和缺氧诱导因子的影响［J］.中国康复医学杂志，2009，24(4):338 -341.

［4］Koyama J，Miyake S，Sasayama T，et al.The novel VEGF receptor antagonist，VGAl155，reduces edema，decreases infarct and improves neurological function after stroke in rats［J］.Kobe J Med Sci，2010，56(1):E1 -E11.

［5］Ren C，Yan Z，Wei D，et al.Limb remote ischemic postconditioning protects against focal ischemia in rats［J］.Brain Res，2009，1288:88-94.

［6］党 莎，罗玉敏，吉训明，等.人重复肢体缺血对血压、心率及组织氧饱和度的影响［J］.基础医学与临床，2008，28(11):1203-1204.

［7］Madias JE.Remote ischemic postconditioningfor no-reflow inpatients undergoing primary percutaneous coronary intervention for ST-elevation myocardial infarction［J］.Am J Cardiol，2011，5(2):281.

［8］XU C，YI C，Guo H，et al.Limb remote ischemicpostconditioning is e-lective but also time-course-limited in protecting the brain from I/R injury［J］.Turk J Med Sci，2012，42(5):918 -929.

［9］Kullander K，Klein R.Mechanisms and functions of Eph and ephrinsignalling［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2002，3:475 -486.

［10］Thundyil J，Manzanero S，Pavlovski D，et al.Evidence That the EphA2 receptor exacerbates ischemic brain injury［J］.Plos One，2013，8(1):e53528.

［11］Zhou N，Zhao WD，Liu DX，et al.Inactivation of EphA2 promotes tight junction formation and impairs angiogenesis in brain endothel ial cells［J］.Microvasc Res，2011，82(2):113 -121.

［12］Goldshmit Y，McLenachan S，Turnley A.Roles of Eph receptors and ephrins in the normal and damaged adult CNS［J］.Brain Res Rev，2006，52:327 -345.

［13］张 坤，张宏义，杨 宏，等.神经干细胞移植对大鼠慢性脊髓损伤的疗效及对EphA2 的影响［J］.中国现代医学杂志，2012，22(28):26 -29.

［12］Masters CL，Simms G，Weinman NA，et al.Amyloid plaque core protein in Alsheimer disease and down syndronle［J］.Proc Nail Aead Sci USA，1985，82:4245 -4249.

［14］栾天竹，戚基萍，王德生，等.局灶性脑缺血海马神经元淀粉样β蛋白及其蛋白前体的表达［J］.中华医学杂志，2011，85(25):1770 -1772.

［15］Hatip FF，Hatip-Al-Khatib I，Matsunaga Y，et al.Effects of 8-residue beta sheet breaker peptides on aged Abeta40-induced memory impairment and Abeta40 expression in rat brain and serum following intraamygdaloid injection［J］.Curr Alzheimer Res，2010，7:602 -614.