实时荧光定量PCR在儿童肺炎支原体感染中的诊断价值

王　晶, 甘轶文, 毛李征, 俞海国

(1. 东南大学医学院附属南京同仁医院 儿科, 江苏 南京, 211102;

2. 南京医科大学附属南京儿童医院 风湿免疫科, 江苏 南京, 210008)

实时荧光定量PCR在儿童肺炎支原体感染中的诊断价值

王晶1, 甘轶文1, 毛李征1, 俞海国2

(1. 东南大学医学院附属南京同仁医院 儿科, 江苏 南京, 211102;

2. 南京医科大学附属南京儿童医院 风湿免疫科, 江苏 南京, 210008)

摘要:目的探讨实时荧光定量PCR(RTFQ-PCR)在儿童肺炎支原体(MP)感染中的诊断价值。方法选取106例肺炎患儿，采集静脉血，以间接荧光免疫法(IFA)检测MP-IgM表达；采集咽拭子标本，以RTFQ-PCR检测MP DNA拷贝数。以血清学检测结果为诊断标准，观察RTFQ-PCR诊断MP的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值，及其在检测不同年龄段患儿MP感染中的准确性；比较MP-IgM阳性和阴性患儿的MP-DNA拷贝数差异。结果① RTFQ-PCR诊断灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为90.48%、93.02%、95.00%、89.96%。绘制受试者工作曲线(ROC曲线)，曲线下面积为0.740; ② RTFQ-PCR诊断6岁以上患儿MP感染的灵敏度和准确率高于1岁以下患儿(P<0.01); ③ MP-IgM阳性组DNA拷贝数对数显著高于阴性组拷贝数对数(P<0.01)。结论RTFQ-PCR诊断儿童MP感染具有较好的准确性，其荧光拷贝数越大越支持MP感染的诊断，对发病早期及年龄较大的患儿可能具有更高的诊断价值。

关键词:实时荧光定量PCR; 儿童; 肺炎支原体; 抗体

肺炎支原体(MP)是急性呼吸道感染的常见病原体，尤其是儿童肺炎的常见病原体[1]，10%～30%的儿童社区获得性肺炎由MP引起，但在MP感染的肺炎与其他病原微生物感染的肺炎在症状、体征等临床特征方面并无特异性差异[2-3]，难以早期、及时诊断，往往导致临床治疗中抗生素的滥用。直接检出病原体是诊断MP的金指标，但MP生长缓慢，分离培养条件较高，且培养耗时较长，临床应用收到诸多限制[4]。实时荧光定量PCR(RTFQ-PCR)可快速检测咽拭子标本中的MP-DNA，近年来在MP所致肺炎的诊断中得到了广泛应用[5]。本研究探讨了RTFQ-PCR检测肺炎患儿MP感染的准确度、特异度等，以期为临床诊断儿童MP感染提供参考，现报告如下。

1资料与方法

1.1　一般资料

选取2012年1月—2014年12月在东南大学医学院附属同仁医院治疗的肺炎患儿106例，均以咳嗽、发热为主要症状，胸片示片状阴影等肺炎特征，排除最近3 d内应用过大环内酯类药物的患儿[6]。其中男35例，女32例；年龄5个月～12岁，平均(5.24±1.48)岁；1岁以下24例，1～6岁44例，6岁以上38例。

1.2　方法

患儿均于入组时采集咽拭子标本，浸于1 mL无菌生理盐水中震荡，密封后-20 ℃冰箱保存，用以RTFQ-PCR检测MP DNA拷贝数，试剂盒购自通派(上海)生物科技有限公司。入组时采集静脉血，以间接荧光免疫法(IFA)检测MP-IgM表达。

1.3　观察指标

① 以IFA血清学检测结果为诊断标准，即双份血清MP抗体滴度升高4倍以上，或单份血清MP-IgM抗体阳性，且滴度≥1∶80诊断为MP感染，观察RTFQ-PCR诊断MMP的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值，以及在检测不同年龄段患儿MP感染中的准确性。灵敏度=真阳性/(真阳性+假阴性)×100%, 特异度=真阴性/(真阴性+假阳性)×100%，阳性预测值=真阳性/(真阳性+假阳性)×100%, 阴性预测值=真阴性/(真阴性+假阴性)×100%; ② 比较MP-IgM阳性和阴性患儿的MP-DNA拷贝数差异。

2结果

2.1　RTFQ-PCR诊断结果

106例肺炎患儿中，IFA法检测出MP-IgM阳性63例，阴性43例；RTFQ-PCR检测出阳性60例(真阳性57例，假阳性3例)，阴性46例(真阴性40例，假阴性6例)。以IFA检测结果为诊断标准，RTFQ-PCR诊断灵敏度为90.48%(57/63), 特异度为93.02%(40/43), 阳性预测值为95.00%(57/60)，阴性预测值为86.96%(40/46)。

2.2　ROC下面积评价RTFQ-PCR对MPP的诊断价值

绘制ROC曲线, AUC=0.740, 表明RTFQ-PCR对MPP具有较好的诊断准确性。

2.3　RTFQ-PCR检测不同年龄段患儿MP感染的结果

RTFQ-PCR检测不同年龄段患儿MP感染的结果见表1，其中1岁以下诊断灵敏度为33.33%(2/6)，特异度为77.78%(14/18), 准确率为66.67%(16/24); 1～6岁诊断灵敏度为96.00%(24/25), 特异度为94.73%(18/19), 准确率为95.45%(42/44); 6岁以上诊断灵敏度为100.00%(31/31), 特异度为85.71%(6/7), 准确率为97.37%(37/38)。3组比较，1～6岁和6岁以上患儿的诊断灵敏度及准确率均高于1岁以下患儿，差异有统计学意义(P<0.01)，但1～6岁和6岁以上患儿之间差异无统计学意义(P>0.05)。

表1　RTFQ-PCR检测不同年龄段患儿MP感染的

2.4　MP-IgM阳性和阴性患儿MP-DNA拷贝数比较

根据血清学检测结果，将106例患儿分为MP-IgM阳性组和阴性组，分别对其PCR拷贝数取对数后进行比较，阳性组拷贝数对数为(5.78±2.03)log(MP-DNA)copy/mL, 阴性组拷贝数对数为(4.12±1.54)log(MP-DNA)copy/mL, 差异有统计学意义(P<0.01)。

3讨论

MP是儿童呼吸道感染的常见病原体，病原体培养是诊断金标准，但MP培养较困难，结果判定耗时需3～4周，因此，血清学MP抗体检测是目前临床应用的主要诊断方法[7-8]，而在各抗体亚型中，只有IgM能提示早期感染[9]，但MP-IgM通常出现于发病后1周，诊断依然存在延后性；且对免疫系统尚未发育完善的新生儿或存在免疫缺陷的患儿，血清学诊断方法存在一定局限性。

RTFQ-PCR是近年来被广泛应用的核酸检测技术，其在常规PCR的基础上增加了能识别扩增产物的探针，并以荧光标记，通过计算机实时描计产物扩增过程中的荧光曲线，并换算成DNA拷贝数，实现准确定量的目标。RTFQ-PCR操作方便，短时间内即可出结果，可显著减少扩增产物的污染机会，从而降低假阳性发生率，在成人和儿童MP感染的诊断中具有较大应用价值[10]。袁艺等[11]报道，在病程第1周，RTFQ-PCR诊断MP的敏感度和特异度分别为92.70%和93.3%，高于血清学检测，但随着病程的延长，血清学检测的敏感度显著升高，因此认为RTFQ-PCR更适合MPP的早期快速诊断。杨勇琼[12]也报道，社区活动性肺炎患者入院第1天，采用RTFQ-PCR的诊断率高于血清学诊断。樊茂等[13]对比了RTFQ-PCR和IFA检测小儿MP感染的阳性率，结果表明2种方法各有利弊，联合应用可提高早期检出率。一项纳入14篇文献的系统评价表明，PCR技术用于诊断MP感染的ROC曲线下面积>0.7，诊断准确率较好[14]。本研究结果表明，RTFQ-PCR检测儿童MP感染的灵敏度和特异度分别为90.47%和93.02%，绘制ROC曲线计算AUC为0.740, 高于张晓波等[15]报道的AUC(0.641); 比较不同年龄段患儿的检出率，结果表明6岁以上患儿的诊断灵敏度高于1岁以下患儿，差异有统计学意义(P<0.01); 6岁以上患儿的诊断准确率高于其他年龄段患儿，但差异无统计学意义(P>0.05), 这可能与样本量较小有关。此外，MP-IgM阳性组DNA拷贝数显著高于阴性组DNA拷贝数，提示RTFQ-PCR检测为阳性的时间可能较血清学抗体检测出现阳性更早，PCR拷贝数越大越能支持诊断结果。因此，对高度怀疑MP感染的患儿，在发病早期即可行RTFQ-PCR检测，结果为阳性且拷贝数较大的患儿，可在发病1周后进一步检测血清抗体，提高诊断准确率。

参考文献

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技术与方法

The diagnostic value of real-time PCR in children with

mycoplasma pneumoniae infection

WANG Jing1, GAN Yiwen1, MAO Lizheng1, YU Haiguo2

(1.DepartmentOfPediatrics,NanjingTongrenHospitalAffiliatedtoMedicalSchool

ofSoutheastUniversity,Nanjing,Jiangsu, 211102; 2.DepartmentofRheumatology,

NanjingChildren′SHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity,Nanjing,Jiangsu, 210008)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the diagnostic value of real-time quantitative PCR (RTFQ-PCR) in children with mycoplasma pneumoniae (MP) infection. MethodsTotally 106 children with pneumonia were choosed and venous blood was collected. Indirect fluorescence immunoassay (IFA) were applied to detected MP-IgM expression. RTFQ-PCR was used to determine the MP DNA copies collected from throat swab specimens. Diagnostic sensitivity, specificity, positive predictive value and negative predictive value of RTFQ-PCR as well as detection accuracy among different ages were observed according to diagnostic criteria serological test. Meanwhile the differences of MP-DNA copies between MP-IgM positive and negative children was compared. Results① Diagnostic sensitivity, specificity, positive predictive value and negative predictive value of RTFQ-PCR were 90.48%, 93.02%, 95.00%, 89.96% respectively. Receiver operating characteristic curve was analysed and the area under the curve was 0.740. ② Sensitivity and accuracy of RTFQ-PCR in MP children over 6 years old were higher than in children under 12 months (P<0.01). ③ Logarithm of DNA copies in MP-IgM positive children was significantly higher than that in MP-IgM negtive children (P<0.01). ConclusionRTFQ-PCR diagnosis of MP infection in children has a favorite accuracy. The greater the fluorescent of copies are, the support with the diagnosis of MP infection goes up. It may have a higher diagnostic value in early onset and older children.

KEYWORDS:mycoplasma pneumonia; real-time quantitative PCR; children; antibody

通信作者:毛李征, E-mail: maolz@njtrh.org

收稿日期:2015-04-03

中图分类号:R 563.1

文献标志码:A

文章编号:1672-2353(2015)15-091-03

DOI:10.7619/jcmp.201515027