重组融合蛋白早期快速诊断侵袭性念珠菌病的实验研究

陈　晶

(解放军白求恩国际和平医院 检验实验科, 河北 石家庄, 050082)

重组融合蛋白早期快速诊断侵袭性念珠菌病的实验研究

陈晶

(解放军白求恩国际和平医院 检验实验科, 河北 石家庄, 050082)

摘要:目的建立一种IC早期快速准确的诊断方法。方法178例临床需要送检侵袭性念珠菌病常规检测和真菌培养的患者血清为研究对象，其中103例确诊为侵袭性念珠菌病者作为病例组，75例为在同样免疫妥协易感人群但无念珠菌感染微生物学证据的患者血清作为对照组。应用基因重组的方法，将念珠菌菌丝壁蛋白(HWP1)，与位于细胞壁的糖酵解酶(烯醇化酶蛋白ENO1)进行基因克隆，随后将由HWP1与ENO1组成的重组蛋白在大肠杆菌中表达，并建立酶联免疫方法(ELISA), 检测患者血清中的IgG特异性抗体。通过统计学的分析，计算出该方法的灵敏度，特异性，阳性预测值，阴性预测值。筛选出灵敏度高，特异性强，阳性预测值和阴性预测值均高的融合蛋白抗原建立的ELISA方法。结果病例组中抗-ENO1、抗-HWP1以及二者联合检测的阳性检出率均显著高于对照组(P<0.01), 差异有统计学意义。抗-HWP1与抗-ENO1两方法相比，抗-HWP1的敏感性(χ2=37.622,P<0.01)、阳预测值(χ2=74.427,P<0.01)及阴性预测值(χ2=2.057,P=0.152)均显著高于抗-ENO1; 联合检测与抗-ENO1比较，敏感性(χ2=44.524,P<0.01)、特异性(χ2=9.765,P=0.002)及阳预测值(χ2=72.000,P<0.01)均显著高于抗-ENO1; 联合检测与抗-HWP1相比，特异性(χ2=4.700,P=0.030)、阴性预测值(χ2=3.191,P=0.074)显著高于抗-HWP1。结论ENO1和HWP1蛋白重组后联合诊断的效果更佳，可以作为IC早期快速准确的诊断方法。

关键词:侵袭性念珠菌病; HWP1; ENO1; 重组蛋白; 实验室诊断

由真菌感染引起的发病近些年来在全世界不断上升，尤其在免疫力受损的人群中表现更为突出，如免疫力低下的患者、器官移植失败以及晚期肿瘤病人等继发性感染大部分均是由真菌感染所引起。侵袭性念珠菌病(IC)已居于血液中分离的病原菌感染的第4位，又以白念珠菌为常见[1-3]。据统计念珠菌菌血症若得不到及时有效的治疗，有高达46%～76%的死亡率[4]。诊断真菌感染的主要依据是医学真菌学检查，而早期特异性诊断在指导临床及时准确使用抗真菌药物中发挥重要作用，是挽救真菌感染患者生命的关键。近年来，抗原重组融合蛋白技术的发展给我们提供良好的实验条件，本研究中作者将菌丝细胞壁的蛋白(HWP1)与烯醇化酶(ENO1)的蛋白基因进行融合，通过原核表达融合蛋白，建立ELISA方法检测血清抗体，以提高其敏感性和特异性，以期其综合性能优于单一抗体的检测，达到早期快速而准确地诊断IC的目的。

1资料与方法

1.1　样本来源

血清样本来源于本院2013年7月—2015年3月留取的178例临床需要送检侵袭性念珠菌病常规检测和真菌培养的患者的血清。其中103份血清检验确诊为侵袭性念珠菌病，作为病例组；另外75份血清为在同样免疫妥协易感人群但无念珠菌感染微生物学证据的患者血清，作为对照组。

1.2　仪器与试剂

白念珠菌标准株购于中国微生物所菌种保藏管理委员会微生物中心; pQE-30表达载体和大肠埃希菌BL21(DE3)来自本实验室; His-Tag小鼠单克隆抗体; DNA提取、DNA片段质粒提取和纯化试剂盒; 溶细胞酶(1yticase); 限制性内切酶Nde I及BamH I; T4连接酶等均购于美国Sigma公司。

1.3　重组融合蛋白的制备和鉴定

1.3.1分别构建HWP1、ENO1原核表达质粒并诱导、纯化蛋白：根据文献报道和GENEBANK，设计HWP1与ENO1的基因引物，引物部分是由Invitrogen公司代为合成的。 RT-PCR法克隆各自的全基因序列，分别与pQE-30载体连接，酶切鉴定后获得HWP1与ENO1两种蛋白的原核表达质粒；经IPTG诱导表达融合蛋白，Western Blot鉴定，获得纯化蛋白。

1.3.2构建HWP1与ENO1连接的原核表达质粒并诱导、纯化蛋白：重叠PCR将HWP1基因与ENO1基因连接在一起后，构建成原核表达质粒，经IPTG诱导表达融合蛋白，Western Blot鉴定，并获得融合的纯化蛋白。

1.4　HWP1与ENO1的检测

采用间接ELISA法测定患者血样中抗-HWP1和抗-ENO1，操作严格按照试剂盒说明书进行。分别以单独一种蛋白和组合的蛋白包被ELISA板，检测相应抗体IgG。检测血液等无菌体液证明的IC患者血清抗体，比较分析融合蛋白和单一蛋白的灵敏度、特异性、阳性预测值和阴性预测值，确定ELISA方法。

1.5　统计学处理

用SPSS 19.0对所得数据进行统计学处理；行χ2检验；P<0.05表示差异具有统计学意义。

2结果

2.1　抗-HWP1、抗-ENO1以及两种联合检测的诊断结果

病例组中抗-ENO1阳性17例，检出阳性率为16.5%, 相比对照组的5.3%的阳性检出率而言，差异有统计学意义(P=0.023)。病例组中抗-HWP1的阳性检出率为65%(67例)，与对照组的2.7%的阳性检出率相比，差异有统计学意义(P<0.01)。病例组中抗-ENO1与抗-HWP1联合检测出阳性88例，检出率为65%，显著高于对照组的1.3%的检出率，差异有统计学意义(P<0.01), 见表1。

表1　抗-HWP1、抗-ENO1以及两种联合检测的诊断结果[n(%)]

与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

2.2　抗-HWP1和抗-ENO1以及两种方法联合检测诊断性能比较

本次研究中，检测 ENO1和 HWP1抗体的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值详见表2。对这三种检测方法进行统计学分析，抗- HWP1与抗-ENO1两方法相比，抗-HWP1的敏感性(χ2=37.622,P<0.01)、阳预测值(χ2=74.427,P<0.01)及阴性预测值(χ2=2.057,P=0.152)均显著高于抗-ENO1，而特异性(χ2=1.008,P=0.315)无显著差异。联合检测与抗-ENO1比较，敏感性(χ2=44.524，P<0.01)、特异性(χ2=9.765,P=0.002)及阳预测值(χ2=72.000，P<0.01)均显著高于抗-ENO1, 差异具有统计学意义，阴性预测值(χ2=0.148,P=0.700)差异无统计学意义。联合检测与抗-HWP1相比，特异性(χ2=4.700,P=0.030)、阴性预测值(χ2=3.191,P=0.074)显著高于抗-HWP1，而敏感性(χ2=0.479,P=0.489)和阳预测值(χ2=0.032,P=0.858)无显著差异。

表2　抗-HWP1和抗-ENO1以及两种方法联合检测

3讨论

念珠菌病是由念珠菌属真菌所引起的一种常见的条件致病菌，通常可在皮肤、黏膜，甚至内脏和各个系统器官与宿主共存，当机体免疫力低下或内环境失调时造成严重感染，是目前发病率最高的深部真菌病[5]。近年来，IC感染的发病率及死亡率显著上升。目前，中国念珠菌病的发生率在0.71‰～0.85‰, 对人们的健康已造成严重的危害[6]。

镜检、真菌培养及组织病理学是诊断真菌实验室的常规检查方法。直接镜检简便、实用，但阳性率低，且阴性结果也不能排除诊断。培养检查可提高病原菌检出阳性率同时确定致病菌种类，还可做体外药敏试验。但鉴定菌种需结合菌落特征、生化试验等，耗时长。并且在正常有菌标本中检出念珠菌的阳性预测值也不高。组织病理学检查对深部真菌感染至关重要，在组织切片中找到病原真菌是确诊的“金标准”[7-8]。然而仅一次切片未必一定能找到真菌，且深部真菌感染易造成各种组织反应，也会对诊断产生很大困难。而且组织病理学检查需要侵入性操作，本身就可能带来比较严重的并发症如出血、感染等，增加了操作的危险性。因此, 传统方法虽然简单实用，然而其具有耗时长、敏感性低、特异性差等缺点，不能很好地对临床早期IC进行特异性诊断。目前真菌感染早期诊断的研究已聚焦于抗原及抗体的检测方法。

目前已得到研究者广泛验证的潜在诊断IC的标志物，主要包括核酸检测、(1, 3)β-D 葡聚糖、甘露聚糖等细胞壁类成分, D-阿拉伯糖醇等代谢产物，分泌性天冬氨酸酶(SAP)、烯醇化酶(ENO1)等抗原成分，但在临床实践中还没有一个得以已广泛接受和应用[9-10]。单就(1, 3)β-D 葡聚糖检测而言，目前已有商品检测试剂盒，该方法敏感度达1 ng/L, 但存在假阳性，所以该方法只能作为系统真菌病的诊断筛查试验。最近有关侵袭性念珠菌感染患者血清抗体的研究结果发现，多个抗体组合比单一抗体对IC的预测价值高，且血清抗体IgG反应优于IgM。因此，检测念珠菌多种血清抗体可提高诊断IC的敏感率。但其检测方法如果应用于临床实验室常规检测，存在检测项目多的缺陷。

细胞壁成分如(1, 3)β-D葡聚糖、甘露聚糖，

抗原成分如分泌性天冬氨酸酶(SAP)以及存在于念珠菌细胞内的烯醇化酶(ENO1)等标志物已成为目前对侵袭性念珠菌病进行早期诊断的研究热点[11]。许多研究[12-13]表明，单一额抗体对侵袭性念珠菌病的早期诊断的敏感性、特异性仍偏低。然而抗原重组融合蛋白技术给我们提供良好的实验条件。本研究中，作者将菌丝细胞壁的蛋白HWP1与烯醇化酶(ENO1)的基因进行融合，通过原核表达融合蛋白，建立ELISA方法检测血清抗体，以提高其敏感性和特异性。实验结果表明，抗-HWP1、抗-ENO1以及两种联合检测三种方法均具有诊断意义；且联合检测的敏感性、特异性及阳预测值均显著高于抗-ENO1(P<0.01); 特异性、阴性预测值显著高于抗-HWP1(P<0.01), 而敏感性和阳性预测值与抗-HWP1相当(P>0.05); 检测效果排序为联合检测优于HWP1检测，优于ENO1检测。说明两种蛋白重组后联合诊断的效果更佳，可以作为IC早期快速准确的诊断方法。

参考文献

[1]郭凤梅, 杨毅, 邱海波. 中国重症患者侵袭性念珠菌感染的流行病学特征[J]. 中华内科杂志, 2014, 53(6): 491.

[2]Pitarch A, Nombela C, Gil C. Serum Antibody Signature Directed against Candida albicans Hsp90 and Enolase Detects Invasive Candidiasis in Non-Neutropenic Patients[J]. Journal of proteome research, 2014, 13(11): 5165.

[3]孔小祥, 李芳秋, 王仕钦, 等. 抗烯醇化酶抗体检测对侵袭性念珠菌病的诊断价值[J]. 临床检验杂志, 2011, 29(6): 413.

[4]Fortún J, Meije Y, Buitrago M J, et al. Clinical validation of a multiplex real-time PCR assay for detection of invasive candidiasis in intensive care unit patients[J]. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2014, 69(11): 3134.

[5]贺政新, 陈晶, 冉向阳, 等. 白念珠菌磷酸甘油酸激酶 1 的原核表达及免疫原性分析[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2013, 29(10): 1079.

[6]Delaloye J, Calandra T. Invasive candidiasis as a cause of sepsis in the critically ill patient[J]. Virulence, 2014, 5(1): 161.

[7]马春芳, 陆静芬, 孔倩倩, 等. 念珠菌优势抗体检测方法的建立及临床诊断价值评估[J]. 医学研究生学报, 2013, 26(11): 1138.

[8]Farooqi J Q, Jabeen K, Saeed N, et al. Invasive candidiasis in Pakistan: clinical characteristics, species distribution and antifungal susceptibility[J]. Journal of medical microbiology, 2013, 62(Pt 2): 259.

[9]Flevari A, Theodorakopoulou M, Velegraki A, et al. Treatment of invasive candidiasis in the elderly: a review[J]. Clinical interventions in aging, 2013, 8: 1199.

[10]陆静芬. 用重组抗原诊断侵袭性念珠菌病[J]. 临床检验杂志, 2012, 30(3): 213.

[11]Orsi C F, Borghi E, Colombari B, et al. Impact of Candida albicans hyphal wall protein 1 (HWP1) genotype on biofilm production and fungal susceptibility to microglial cells[J]. Microbial pathogenesis, 2014, 69: 20.

[12]李芳秋, 胡毓安, 史利宁, 等. 侵袭性念珠菌病患者抗烯醇化酶抗体水平升降及影响因素[J]. 临床检验杂志, 2014, 32(11): 817.

[13]饶志刚, 赵子文. 真菌抗原检测在侵袭性肺真菌病诊断中的价值[J]. 广东医学, 2012, 33(21): 3273.

Research on recombinant fusion protein in early

fast diagnosis of invasive candidiasis

CHEN Jing

(DepartmentofClinicalLaboratory,BethuneInternationalPeaceHospitalofPLA,

Shijiazhuang,Hebei, 050082)

ABSTRACT:ObjectiveTo establish a early fast diagnostic method for invasive candidiasis.MethodsA total of 178 patients′ serums demanding laboratory detection of invasive candidiasis and fungus culture were selected as the research objects, among which 103 serum samples diagnosed invasive candidiasis were included in the disease group and another 75 serum samples in the immunocompromised susceptible population but without monilial infection were as the control group. Candida albicans hyphal wall protein (HWP1) and glycolytic enzyme (enolase protein ENO1) located in the cell wall were cloned by gene recombination, and the recombinant protein composed of HWP1 and ENO1 were expressed in Escherichia coli. Further more, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) was established to detect specificity antibodies of IgG in the serum of the patients. Statistical analysis was used to calculate the sensitivity, specificity, positive prediction value, and negative prediction value. Meanwhile, the fusion protein antigen with higher sensitivity, specificity, positive prediction value and negative prediction value was screened. ResultsThe positive detection rates of anti -ENO1, anti -HWP1 and combined detection were significantly higher than that in control group, the difference was statistically significant(P<0.01). Comparison of Anti-HWP1 and anti-ENO1 showed that the sensitivity of anti-HWP1 (χ2=37.622,P<0.01), positive predictive value (χ2=74.427,P<0.01) and negative predictive value (χ2=2.057,P=0.152) were significantly higher than that of anti-ENO1. The sensitivity(χ2=44.524,P<0.01) and specific of (χ2=9.765,P=0.002) and positive predictive value (χ2=72.000,P<0.01 of joint detection were significantly higher than that anti-ENO1. The specificity (χ2=4.700,P=0.030) and negative predictive value (χ2=3.191,P=0.074) of joint detection was significantly higher than that of anti-HWP1. ConclusionJoint diagnosis has better efficacy after recombinant protein of ENO1 and HWP1 protein, and it can be used as a rapid and accurate method for early diagnosis of IC.

KEYWORDS:invasive candidiasis; HWP1; ENO1; recombinant protein; laboratory diagnosis

基金项目:河北省自然科学基金项目(C2010001882)

收稿日期:2015-04-20

中图分类号:R 519.3

文献标志码:A

文章编号:1672-2353(2015)15-055-03

DOI:10.7619/jcmp.201515016