p16基因甲基化在胃癌发病机制中的作用

崔　勇, 张　刚, 李　中, 林晓萌, 张军华

(河北大学附属医院 肿瘤外科, 河北 保定, 071000)

p16基因甲基化在胃癌发病机制中的作用

崔勇, 张刚, 李中, 林晓萌, 张军华

(河北大学附属医院 肿瘤外科, 河北 保定, 071000)

摘要:目的通过检测胃癌组织p16基因的启动子CpG岛甲基化状态，探讨其在胃癌发病机制中的作用，及其与胃癌临床病理特征之间的关系。方法选取经胃镜检查诊断为胃癌的74例患者(胃癌组)及36例胃黏膜组织正常者(对照组)，应用甲基化特异性PCR(MSP)检测正常胃黏膜组织和胃癌组织p16基因的启动子CpG岛的甲基化状态，并分析p16基因甲基化与胃癌临床病理特征之间的关系。结果胃癌组p16基因的甲基化阳性率为56.8%, 对照组未发现p16基因甲基化，差异具有统计学意义(P<0.05); p16基因甲基化表达与胃癌患者的淋巴结转移、远处转移及病变的浸润深度有关(P<0.05), 但与性别、年龄、肿瘤大小、部位和组织学类型无关。结论在胃癌发生发展中，p16基因甲基化修饰起着非常重要的作用，可作为反映胃癌侵袭转移的生物学指标。

关键词:p16基因; 甲基化; 胃癌; 生物学指标

胃癌是临床较为常见的消化道恶性肿瘤，多种抑癌基因的失活以及癌基因的活化是导致其发生的重要原因[1]。p16基因作为肿瘤抑制基因，其表达异常将导致肿瘤的发生发展[2-3]。遗传学研究表明，抑癌基因启动子区域CpG岛的异常甲基化与胃癌的形成密切相关[4]。因此，本研究检测p16基因启动子在胃癌组织中的甲基化状况，并对比正常胃黏膜组织p16基因甲基化表达，旨在探讨胃癌发病机制中p16基因甲基化的作用以及其与胃癌临床病理特征之间的关系。

1资料与方法

1.1　一般资料

选择2013年1月—2014年10月河北大学附属医院收治的74例胃癌患者设为胃癌组，所有患者均经胃镜检查，并经手术及病理确诊为胃癌。其中男45例，女29例；年龄35～85岁，平均(57.4±5.2)岁。肿瘤分化程度：高分化17例，中分化22例，低分化35例；肿瘤发生部位：贲门胃底11例，胃体26例，胃窦37例；TNM分期：I期19例，Ⅱ期13例，Ⅲ期20例，Ⅳ期22例；肿瘤直径：直径<5 cm 53例，≥5 cm 21例。另选择本院同期行胃镜检查且胃黏膜正常的人群作为对照组，共36例。其中男16例，女20例；年龄29～75岁，平均(55.5±4.2)岁。2组患者年龄、性别等一般资料比较无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。2组患者均取典型病变组织，置于-80 ℃冰箱内保存待用。

1.2　方法

1.2.1亚硫酸氢盐修饰及DNA提取：按照美国Epigentek公司产品说明书进行亚硫酸氢盐修饰操作。基因组DNA的提取按照大连TaKaRa公司试剂盒说明书进行；提取产物的DNA浓度和纯度由美国Bio-Rad公司Smart Spec plus核酸测定仪检测，若OD260/OD280在1.6～1.8, 置于-20 ℃的冰箱备用。

1.2.2聚合酶链反应(PCR): 应用甲基化和非甲基化特异性引物将已进行修饰的DNA进行PCR, 并参考其他学者的研究进行p16基因引物设计[5]。PCR反应体系：Taq酶0.5 μL, 模板DNA 2.5 ng, 上游引物1 μL, 下游引物1 μL, Buffer 25 μL, dNTP 8 μL，灭菌蒸馏水加至50 μL。p16-M引物序列(甲基化特异性引物): 5′-TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC-3′, 5′-GA CCCCGAACCGCGACCGTAA-3′, 退火温度为62 ℃, 产物长度150 bp。p16-U引物序列(非甲基化特异性引物): 5′-TTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGT-3′, 5′-CAACCCCAAACCACAACCATAA-3′, 退火温度为62 ℃, 产物长度151 bp。PCR产物行4%琼脂糖电泳，经Gel DocTM XR凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)进行分析。

1.3　统计学分析

应用SPSS 13.0统计分析软件进行Fisher精确检验或χ2检验。相关性分析采用Spearman检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1　p16基因甲基化

在胃癌组患者中, p16基因甲基化阳性为42例，检出率56.8%, 对照组未发现p16基因甲基化，两组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。见图1。

1.胃癌组;2.对照组图1 2组p16基因甲基化分析

2.2　p16基因甲基化与胃癌临床病理特征之间的关系

如表1所示，p16基因甲基化与胃癌患者性别、年龄、肿瘤部位、大小和组织学类型无明显相关性(P>0.05)，而与淋巴结转移、远处转移和病变的浸润密切相关(P<0.05)。

表1　p16基因甲基化与胃癌临床病理特征的关系

3讨论

胃癌为消化道最常见恶性肿瘤，亚洲韩国、日本和中国是胃癌高发区，中国年发病率和死亡率是世界平均水平的2倍[6]。遗传学研究结果表明，抑癌基因启动子区域CpG岛的异常甲基化修饰在肿瘤的形成中发挥重要作用[7-8]。甲基化修饰通过多种机制参与转录调控，如下所示: ① 下同干扰识别序列与特异性结合蛋白的结合; ② 间接抑制基因的表达，主要通过组蛋白甲基化转移酶/组蛋白去乙酰化酶结合甲基化位点上的结合蛋白，形成核小体来实现。

p16基因位于染色体9p21区，主要在CDK6- PRb-E2F/cyclinDl-CDK4环路中发挥负反馈调节作用。p16基因变异将导致cyclinDl-CDK4/CDK6- PRb-E2F环路无限制进行下去，进而导致细胞过度增殖、癌症发生[9]。有学者的研究表明，肺癌、结肠癌、肝癌等癌症患者的癌组织标本、肿瘤细胞株中，频繁出现p16基因甲基化现象[10-12], 这种甲基化现象可能是p16表达无表达或下调的主要原因之一。在本研究中，正常胃黏膜组织均未见p16基因甲基化片段(阳性)，但胃癌组织中p16基因甲基化的检出率为56.8%, 这与国内学者的研究结果相一致[13-14]。为进一步p16基因甲基化与胃癌的相关性，有学者应用5-氟尿嘧啶辅助化疗，对胃癌患者术后进行治疗，结果发现，5-氟尿嘧啶能有效降低p16基因甲基化阳性胃癌患者的复发率，其原因可能是胃癌组织p16基因甲基化，导致p16蛋白表达减少；而处于S期的癌细胞数量的增加，增加了5-氟尿嘧啶的吸收水平，从而促进了5-氟尿嘧啶抑制胃癌细胞的作用[15]。可见，检测胃癌患者癌组织中p16基因甲基化，不仅能诊断胃癌，还可以为胃癌患者术后治疗和预后评估提供重要理论依据。

本研究对p16基因甲基化和胃癌患者临床病理特征之间的关系进行了进一步的分析，结果表明，p16基因甲基化与胃癌患者年龄、性别、肿瘤部位、大小及组织学类型无关，而与胃癌淋巴结转移及病变的浸润深度密切相关。胃癌淋巴结转移、远处转移及病变的浸润深度是反映胃癌病变、预后的重要标准，直接反映了癌细胞侵袭、转移的能力。本研究中，胃癌组织中p16基因甲基化与胃癌分析密切相关，提示p16基因甲基化与胃癌侵袭、转移能力有关。可见，p16基因甲基化是进一步探索肿瘤转移机制的重要靶点。

综上所述，对p16基因启动子进行甲基化检测，并结合病理学检测结果，能提高胃癌检出率。在胃癌发生发展中，p16基因甲基化修饰起着非常重要的作用，可作为反映胃癌侵袭转移的生物学指标。

参考文献

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Role of p16 gene methylation in the

pathogenesis of gastric cancer

CUI Yong, ZHANG Gang, LI Zhong, LIN Xiaomeng, ZHANG Junhua

(SurgicalOncology,AffiliatedHospitalofHebeiUniversity,Baoding,Hebei, 071000)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the effect of p16 gene methylation in the pathogenesis of gastric cancer by detecting the methylation state of promoter CpG island of p16 gene in gastric cancer tissue, and its relationship with the clinicopathological features. MethodsThe methylation state of promoter CpG island of p16 gene in tissues of 74 patients with gastric cancer (gastric cancer group) and 36 normal people (control group) confirmed by stomachoscopy was detected by methylation specific PCR (MSP) for analyzing the relationship between the p16 gene methylation and clinicopathological features. ResultsThe positive methylation rate of p16 gene in gastric cancer group was 56.8%, with significant difference compared with control group (P<0.05), for p16 gene methylation was not found in control group. Moreover, the expression of p16 gene methylation was related to lymphatic metastasis, distant metastasis, depth of infiltration of lesion (P<0.05), but not associated with gender, age, tumor size, lesion location and histological type (P>0.05). Conclusionp 16 gene methylation modification, which plays an important role in pathogenesis of gastric cancer, can be a biological indicator of reflexing invasion and metastasis of gastric.

KEYWORDS:p16 gene; methylation; gastric cancer; biological indicator

通信作者:张刚, E-mail: zhanggang263@sina.com

基金项目:中国高校医学期刊临床专项资金(11521302)

收稿日期:2015-03-23

中图分类号:R 735.2

文献标志码:A

文章编号:1672-2353(2015)15-049-03

DOI:10.7619/jcmp.201515014