顶空气相色谱法测定胡黄连苷Ⅱ原料药中7种有机溶剂残留量

汪 斌，郑 璐，姚仲青，李 鹏，薛 明，陈炜伟（扬子江药业集团中药研究院，江苏泰州 225321）

胡黄连苷Ⅱ（PicrosideⅡ）是从玄参科多年生植物胡黄连的干燥根茎中分离提纯的环烯醚萜类化合物[1-2]，具有保肝利胆、抗菌抗炎、调节血脂的作用[3-4]。在胡黄连苷Ⅱ制备过程中，可能会残留一定量的有机溶剂。为保证药品质量和用药安全，应严格限制制备过程中带入的残留溶剂含量。但目前有关胡黄连苷Ⅱ原料药中有机溶剂残留量的测定尚未有文献报道。为此，笔者根据2010 版《中国药典》（二部）中关于残留溶剂测定法的指导原则[5]，采用顶空气相色谱法[6]，对胡黄连苷Ⅱ原料药中有机溶剂残留量进行了系统分析，建立了同时测定胡黄连苷Ⅱ原料药中甲醇、乙醇、乙酸乙酯、苯、甲苯、苯乙烯和二乙烯苯7种溶剂量残留的方法。

1 材料

7890B 型气相色谱仪，包括7697A 型自动顶空进样器（美国Agilent公司）；GWA-UN2-C30型超纯水器（北京普析通用仪器有限责任公司）；XS205Dual Range十万分之一分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；KH-700DB 型数控超声仪（昆山禾创超声仪器有限公司）。

胡黄连苷Ⅱ（扬子江药业集团有限公司，批号：20140405-1、20140405-2、20140405-3，纯度均＞96%）；甲醇、乙醇、乙酸乙酯、甲苯、苯、苯乙烯、二乙烯苯对照品（纯度均＞99.5%），N-N二甲基甲酰胺（DMF）均购至国药集团化学试剂有限公司均为色谱纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：以6%氰丙基苯-94%二甲基硅氧烷（DB-624）为固定液的毛细管柱（30 m×0.32 mm，1.80 μm）；程序升温：初始温度40 ℃，保持10 min，以10 ℃/min 升温至220 ℃，保持10 min；进样口温度：200 ℃；检测器：氢火焰离子化检测器（FID）；温度：250 ℃；载气：高纯氮气；载气流速：35 ml/min；分流比：10∶1；顶空加热温度：85 ℃；平衡时间：45 min；顶空瓶装样量：5 ml；进样量：1 ml。

2.2 溶液的制备

2.2.1 空白溶液 精密量取50%DMF 5 ml，置于20 ml顶空瓶中，加盖密封，作为空白溶液。

2.2.2 对照品贮备液 取甲醇对照品300 mg、乙醇对照品500 mg、乙酸乙酯对照品500 mg、甲苯对照品90 mg，分别置于10 ml 量瓶中，加入50%DMF 溶解并定容，得甲醇、乙醇、乙酸乙酯、甲苯对照品贮备液；精密称取苯10 mg，置于10 ml 量瓶中，加入50%DMF溶解并定容，精密量取1 ml，置于50 ml量瓶中，加入50%DMF溶解并定容，得苯对照品贮备液；精密称取苯乙烯、二乙烯苯各20 mg，分别置于10 ml 量瓶中，加入50%DMF溶解并定容，分别精密量取1 ml，置于10 ml量瓶中，加入50%DMF溶解并定容，得苯乙烯、二乙烯苯对照品贮备液。

2.2.3 混合对照品溶液 分别精密量取上述对照品贮备液1 ml，置于同一100 ml 量瓶中，加入50%DMF 溶解并定容，摇匀，精密量取5 ml，置于20 ml顶空进样瓶中，作为混合对照品溶液。

2.2.4 供试品溶液 精密称取胡黄连苷Ⅱ0.25 g，置于顶空进样瓶中，精密加入50%DMF 5 ml，加盖密封，超声（功率：100 W，频率：40 kHz）处理5 min，即得。

2.3 专属性试验

取“2.2”项下空白溶液、混合对照品溶液及供试品溶液各适量，按“2.1”项下气相色谱条件进样测定，记录色谱，详见图1。结果表明，空白溶液中的杂质峰对测定无干扰。

2.4 线性关系考察

分别精密量取“2.2.2”项下各对照品贮备液各1 ml，置于同一25 ml 量瓶中，加入50%DMF 溶解并定容，摇匀，作为混合对照品贮备液。分别精密量取混合对照贮备液0.50、0.75、1.00、1.50、1.75、2.00 ml，置于10 ml 量瓶中，分别加入50%DMF 溶解并定容；分别精密量取5 ml，置于顶空进样瓶中，按“2.1”项下气相色谱条件进样测定，记录峰面积。以质量浓度（x，μg/ml）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，回归方程及线性范围详见表1。

图1 气相色谱图A.空白溶液；B.对照品溶液；C.供试品溶液；1.甲醇；2.乙醇；3.乙酸乙酯；4.苯；5.甲苯6.DMF溶液；7.苯乙烯；8～13.二乙烯苯Fig 1 GC chromatogramsA.blank solution；B.reference solution；C.test sample solution；1.methanol；2.ethanol；3.ethyl acenitrile；4.benzene；5.methylbenzene；6.DMF solution；7.phenylethylene；8-13.divinylbenzene

表1 回归方程及线性范围Tab 1 Regressive equations and linear ranges

2.5 检测限及定量限[5]

以信噪比为3 计算甲醇、乙醇、乙酸乙酯、苯、甲苯、苯乙烯、二乙烯苯的检测限分别为0.05、1.12、0.02、12.62、5.16、1.40、450.00 ng/ml；以信噪比为10 计算甲醇、乙醇、乙酸乙酯、苯、甲苯、苯乙烯、二乙烯苯的定量限分别为0.16、4.30、0.07、37.00、18.30、4.39、550.00 ng/ml。

2.6 精密度试验

按“2.4”项下方法制备甲醇、乙醇、乙酸乙酯、甲苯质量浓度分别为0.188、0.307、0.302、0.062 7 mg/ml，苯、苯乙烯、二乙烯苯质量浓度分别为0.118、1.745、1.880 μg/ml 的混合对照品溶液，按“2.1”项下气相色谱条件进样测定6 次，记录峰面积。结果，各成分峰面积的RSD 均小于3%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

精密吸取“2.2.4”项下供试品溶液（批号：20140405-1）适量，于室温（25 ℃）下放置0、2、4、6、8、10 h时按“2.1”项下气相色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，各成分峰面积的RSD均小于3%（n＝6），表明供试品溶液在10 h内稳定性良好。

2.8 重复性试验

精密称取胡黄连苷Ⅱ（批号：20140405-1）适量，按“2.2.4”项下方法制备供试品溶液6 份，再按“2.1”项下气相色谱条件进行测定，记录峰面积。结果，各成分均未检出，表明本方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验

精密称取样品（批号：20140405-1）6 份，每份约0.25 g，置于各顶空进样瓶中。另按“2.2.2”项下方法制备相当于各对照品质量浓度的100%的标准溶液，分别取该标准溶液5 ml 加入盛有样品的顶空进样瓶中，再按“2.1”项下气相色谱条件进样，计算加样回收率，结果见表2。

表2 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 2 Results of recovery rate（n＝6）

2.10 样品中有机溶剂残留量的测定

取3 批样品（20140405-1、20140405-2、20140405-3）各适量，按“2.2.4”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下气相色谱条件进样测定，以外标一点定量法计算有机溶剂残留量。结果，3批样品均未检出。

3 讨论

3.1 检测指标的确立

胡黄连苷Ⅱ原料药在分离和纯化过程中均使用了HPD-100 型大孔吸附树脂及有机溶剂甲醇、乙醇、乙酸乙酯，从用药的安全性考虑，本试验对大孔树脂可能引入的苯、甲苯、苯乙烯、二乙烯苯及制备纯化过程使用的甲醇、乙醇、乙酸乙酯的残留量进行控制。

3.2 溶剂的选择

胡黄连苷Ⅱ中可能存在的残留溶剂在50%DMF中溶解度较好，且DMF 沸点高，对其他峰的干扰较小。故将50%DMF作为本研究的溶剂。

3.3 色谱条件的选择

本试验选择顶空进样的方法，避免了样品中难溶性物质对色谱柱的污染；检测的有机溶剂组分较多，极性差异大，笔者曾选用HP-5毛细管柱测定有机物残留，发现各组分不能达到基线分离，且DMF对测定有干扰；选用DB-624毛细管柱，各组分均能获得较好的分离，峰型较好，且DMF不影响测定。采用程序升温的方式，使7 种有机溶剂达到了完全分离，且缩短了分析周期，提高了检测效率。在加样回收率试验中，甲醇、乙醇、乙酸乙酯及苯的沸点较低，甲苯、二乙烯苯沸点较高，加样回收率较高；苯乙烯沸点较高，加样回收率较低，但均符合气相色谱要求[7-8]，且RSD均小于3.5%。

综上所述，该方法专属性强，操作简便快速，结果准确，可用于胡黄连苷Ⅱ原料药有机溶剂残留量的测定。

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[5]国家药典委员会.中华人民共和国药典：二部[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：附录61.

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