饥饿素对贫铀所致MC3T3-E1细胞损伤的保护作用研究

郝玉徽，黄嘉伟，刘　聪，李　蓉　(第三军医大学军事预防医学院复合伤研究所，重庆 400038)

饥饿素对贫铀所致MC3T3-E1细胞损伤的保护作用研究

郝玉徽，黄嘉伟，刘聪，李蓉(第三军医大学军事预防医学院复合伤研究所，重庆 400038)

[摘要]目的评价饥饿素对贫铀(DU)所致成骨细胞(MC3T3-E1细胞)损伤的影响。方法不同浓度的饥饿素提前1 h预处理MC3T3-E1细胞后暴露于DU(500 μM)24 h，检测细胞存活率、细胞内抗酒石酸酸性磷酸酶(StrACP)、碱性磷酸酶(AKP)、骨保护素(OPG)、可溶性核因子-κB受体活化因子配体(sRANKL)含量以及细胞内过氧化氢酶(CAT)和活性氧(ROS)水平。结果饥饿素预处理可明显提高DU暴露后细胞存活率及CAT含量，降低细胞内StrACP、AKP、sRANKL/OPG以及ROS水平，并且存在剂量依赖关系。结论饥饿素通过调节OPG/RANKL系统的失衡以及降低细胞内氧化应激，发挥对DU暴露后MC3T3-E1细胞的保护作用。

[关键词]饥饿素；贫铀；成骨细胞；活性氧

贫铀(depleted uranium，DU)是天然铀经过提炼浓缩核燃料-铀(235U)之后的剩余产物，其235U含量低于0.72%，主要由238U构成，具有放射毒性和重金属毒性双重作用，但主要危害在于其重金属毒性[1]。骨骼是DU慢性暴露的主要蓄积器官，骨铀含量可作为评估慢性铀暴露的主要指标。朱国英等[2]研究表明，DU片嵌入损伤可致骨量明显降低、骨生物力学性能下降、骨组织结构出现明显损伤，并存在剂量和时间效应。然而目前为止，几乎没有关于DU引起骨损伤的救治研究。

饥饿素(Ghrelin)是一种含有28个氨基酸残基的脑肠肽，主要由由胃肠道分泌[3]，其可明显减轻10 Gy电离辐射所引起的大鼠肠道细胞的凋亡[4]。有研究显示，饥饿素可调节骨代谢和骨细胞的功能，并能够抑制成骨细胞的凋亡，促进骨骼生长[5]。然而，饥饿素对DU引起骨损伤的影响还未见报道。本研究通过成骨细胞(MC3T3-E1细胞)暴露于DU建立实验模型，从骨代谢、骨保护素(OPG)/核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)系统调节及氧化应激等方面初步探究饥饿素对DU所致MC3T3-E1细胞损伤的保护作用。

1材料与方法

1.1主要试剂及配制

贫铀溶液的制备：配制成质量浓度为25 mg/mL的溶液，取500 mg的DU片(238U占99.75%，235U占0.2%及痕量234U)，溶于5 mL硝酸中，微热，溶解，双蒸水稀释至20 mL(配好后调pH至中性)。过滤灭菌，4 ℃保存，备用。

MC3T3-E1细胞购自美国ATCC细胞库，饥饿素购自成都凯捷生物技术有限公司，抗酒石酸酸性磷酸酶(StrACP)试剂盒、碱性磷酸酶(AKP)试剂盒、过氧化氢酶(CAT)试剂盒购自南京建成生物技术研究所。OPG检测试剂盒、可溶性核因子-κB受体活化因子配体(sRANKL)检测试剂盒购自上海生工。BCA蛋白浓度测定试剂盒、活性氧(ROS)检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所。CCK-8细胞增殖毒性检测试剂盒购自东仁化学科技公司。DMEM培养基购自Hyclone公司。胎牛血清购自Gibco公司。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养MC3T3-E1细胞株用含体积分数10% FBS、100 kU/L青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM置于37 ℃，体积分数5%CO2的细胞培养箱中培养，取生长状态良好的细胞用于实验。

1.2.2CCK-8细胞增殖毒性检测试验分析细胞存活将生长状态良好的MC3T3-E1细胞接种于96孔板，接种量为2×104个/孔，待细胞生长旺盛时进行实验，分为以下几组：对照组(control组，不作任何处理)，贫铀组(DU组，加入贫铀溶液，使培养液中贫铀浓度最终达到500 μM)，饥饿素处理组(DU+G 0.01、DU+G 0.1、DU+G 1、DU+G 10、DU+G 100组，培养液中加入饥饿素使其最终浓度分别达到0.01 nM、0.1 nM、1 nM、10 nM、100 nM，1 h后再加入贫铀溶液使其最终浓度达到500 μM)，每组设5个复孔，细胞置于37 ℃、5%CO2培养箱内培养24 h，吸干培养液后加入含10 μl CCK-8 的新鲜培养液100 μl，孵育1 h，450 nm波长测量吸光值(OD值) ，根据OD值计算细胞存活率。细胞存活率(%)=(实验组OD值-空白OD值)/(对照组OD值-空白OD值)×100%。其中空白组为单纯培养基加上CCK-8 试剂。

1.2.3细胞提取液制备将生长状态良好的MC3T3-E1细胞接种于100 mL培养瓶中，接种量为106个/瓶，待细胞生长旺盛时进行实验，分组情况与1.2.2相同，细胞置于37 ℃、5%CO2培养箱内培养24 h，吸取细胞培养液，备用。用胰酶消化细胞，并收集至备用的细胞培养液中。4 ℃ 600 g离心5 min收集细胞，除去上清，PBS洗涤1次，除去上清，按照每200万细胞加入100 μl裂解液的比例加入裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解15 min，4 ℃ 16 000～20 000 g离心15 min，吸取上清，BCA法测定蛋白浓度后-70 ℃保存备用。

1.2.4细胞内StrACP、AKP、OPG、sRANKL、CAT的测定分别按照相关试剂盒说明书对细胞提取液中StrACP、AKP、OPG、sRANKL、CAT的含量进行测定。

1.2.5细胞内ROS检测将生长状态良好的MC3T3-E1细胞接种于6孔板，接种量为2×105个/孔，待细胞生长旺盛时进行实验，分组情况与1.2.2相同，细胞置于37 ℃、5%CO2培养箱内培养24 h，去除细胞培养液，每孔加入2 mL浓度为10 μM的荧光探针DCFH-DA工作液，37 ℃孵育20 min，用无血清细胞培养液洗涤细胞3次，荧光显微镜下观察。

1.3统计学分析

2结果

2.1饥饿素对DU暴露后细胞存活率的影响

MC3T3-E1细胞暴露于DU(500 μM)24 h后，DU组与control组相比存活率显著降低(P<0.05)，饥饿素处理组(DU+G0.01～DU+G100组)与DU组相比存活率明显升高(P<0.05)，且细胞存活率随饥饿素浓度浓度的增高逐渐增高(图1)。本结果表明饥饿素对DU暴露后的MC3T3-E1细胞具有明显的细胞保护作用。

*：与DU组相比，P<0.05

2.2饥饿素对DU暴露后骨代谢的影响

如图2所示，正常情况下MC3T3-E1细胞内StrACP处于较低水平，暴露于DU(500 μM)24 h后，DU组与control组相比，StrACP水平显著上升(P<0.05)，而饥饿素处理组(DU+G1、DU+G10、DU+G100组)与DU组相比，StrACP水平明显下降(P<0.05)，且StrACP水平随饥饿素浓度的增高逐渐降低；同时，DU组与control组相比，AKP水平显著上升(P<0.05)，饥饿素处理组(DU+G1、DU+G10、DU+G100组)与DU组相比AKP水平明显下降(P<0.05)，且AKP水平随饥饿素浓度的增高呈现下降的趋势。

*：与DU组相比，P<0.05

2.3饥饿素对DU暴露后骨代谢OPG/RANKL系统的影响

如图3所示，正常情况下MC3T3-E1细胞内sRANKL处于较低水平，暴露于DU(500 μM)24 h后，DU组与control组相比，sRANKL水平显著上升(P<0.05)，而饥饿素处理组(DU+G1、DU+G10、DU+G100组)与DU组相比，sRANKL水平明显下降(P<0.05)，且sRANKL水平随饥饿素浓度的增高呈现下降趋势；同时DU组与control组相比，OPG水平显著下降(P<0.05)，饥饿素处理组(DU+G1、DU+G10、DU+G100组)与DU组相比，OPG水平明显升高(P<0.05)，且OPG水平随饥饿素浓度的增高逐渐增高。对于sRANKL/OPG，DU组与control组相比显著上升(P<0.05)，饥饿素处理组(DU+G1、DU+G10、DU+G100组)与DU组相比，sRANKL/OPG水平明显下降(P<0.05)，且sRANKL/OPG水平随饥饿素浓度的增高呈现下降趋势。

*：与DU组相比，P<0.05；#：组间两两比较，P<0.05

2.4饥饿素对DU暴露后细胞氧化应激的影响

MC3T3-E1细胞暴露于DU(500 μM)24 h后，DU组与control组相比，CAT水平显著降低(P<0.05)，而饥饿素处理组(DU+G1、DU+G10、DU+G100组)与DU组相比，CAT水平明显升高(P<0.05)，且CAT水平随饥饿素浓度的增高逐渐增高(图4)。

*：与DU组相比，P<0.05；#：组间两两比较，P<0.05

2.5饥饿素对DU中毒后ROS的影响

如图5所示，正常情况下细胞ROS活性低，在荧光显微镜下观察并不明显，DU组细胞ROS活性与正常组相比明显升高，而饥饿素处理组(DU+G1、DU+G10、DU+G100组)与DU组相比ROS活性逐步降低。

3讨论

针对DU中毒的救治，目前研究多重视通过合成螯合剂进行体内铀的促排，探索出一系列的药物[6-7]，并认为具有明显的DU促排效果。但是，促排药的使用还有一定的争议，因为它们和铀形成复合物后需要由肾排出，有可能会加重肾损伤[8]。事实上，除了DU促排外，阻断DU在生物体内的作用途径，减轻DU对组织细胞的损伤，也是一种重要的救治方法。饥饿素是生长激素分泌受体-1a(GHSR-1a)的内源性配体，参与机体重要的生物学功能，例如能量代谢、抗炎症、抗氧化及细胞的增殖和凋亡等[3]。本研究从细胞存活率骨代谢、OPG/RANKL系统调节及氧化应激等几方面初步证实，饥饿素对贫铀所致MC3T3-E1细胞损伤具有明显的保护作用。

本研究通过细胞增殖毒性检测试验发现，DU对细胞具有明显的毒性作用，而饥饿素有效地提高了DU暴露后MC3T3-E1细胞的存活率，并且存活率随饥饿素浓度增大而升高。提示饥饿素对DU暴露后的MC3T3-E1细胞具有明显的保护作用，且保护作用与饥饿素的浓度呈正相关。

本研究还观察了饥饿素对骨代谢的影响，着重讨论饥饿素对StrACP和AKP的影响情况。StrACP是酸性磷酸酶(ACP)同功酶的第5型，是公认的鉴别破骨细胞的标志之一，主要存在于破骨细胞、巨噬细胞中。骨吸收时，StrACP参与骨基质中固体钙磷矿化底物的降解。因此，StrACP标志着破骨细胞的活性，并在一定程度上反映了骨吸收状况[9]。DU暴露后细胞StrACP水平明显升高，饥饿素有效降低了DU暴露后StrACP的浓度，且StrACP的浓度与饥饿素的浓度呈负相关，提示饥饿素对破骨细胞的活性具有一定的抑制作用，进而一定程度抑制骨吸收。AKP是成骨细胞分化时所分泌的酶，它的主要功能是在碱性条件下(pH7.6～9.9)水解多种磷酸酯并具有转磷酸基作用。AKP被普遍认为是成骨细胞分化和功能的标志，能够反映成骨细胞合成Ⅰ型胶原、形成骨基质的能力，其活性的高低可反映成骨细胞的成熟状况[10]。DU暴露后细胞AKP水平明显升高，饥饿素有效降低了DU暴露后AKP的浓度，且AKP的浓度与饥饿素的浓度呈负相关，提示饥饿素提高成骨细胞的活性，进而促进骨生成。饥饿素抑制破骨细胞活性同时提高成骨细胞活性，使得骨吸收减少而骨生成增加，对骨代谢产生明显影响。

a:Control；b：DU；c:DU+G1;d:DU+G10;e:DU+G100

本研究评价了饥饿素对骨代谢OPG/RANKL系统的影响。OPG/RANKL系统是调节破骨细胞分化的重要信号传导通路[11]，在骨形成和吸收的动态平衡中发挥重要作用：成骨细胞及骨髓基质细胞表达sRANKL，与破骨细胞前体细胞或破骨细胞表面上的RANK结合后，促进破骨细胞分化和激活；成骨细胞及骨髓基质细胞则分泌OPG与sRANKL竞争性结合，阻止sRANKL与RANK结合，从而抑制破骨细胞活性[12]。饥饿素有效降低DU暴露后细胞sRANKL的浓度，使得破骨细胞分化和激活受到抑制；同时升高OPG的浓度，抑制破骨细胞活性，总体上使得sRANKL/OPG显著降低，从而抑制破骨细胞活性，增强成骨细胞活性，减少骨吸收增加骨生成。

本研究探究了饥饿素对DU中毒后细胞氧化应激的影响。氧化应激对成骨细胞的作用表现为抑制细胞增殖、阻碍细胞分化成熟、抑制成骨细胞分泌骨基质及骨基质的矿化，导致成骨细胞活性下降甚至死亡[13]。其中，CAT不但能阻止H2O2转变为羟自由基(·OH),还能使之分解为H2O和O2,从而降低活性氧自由基的含量,保护细胞免受氧化损伤[14]。DU暴露后细胞CAT水平明显升高，饥饿素有效提升DU暴露后细胞CAT水平，使得H2O2迅速分解为H2O和O2，有效降低细胞内羟自由基水平，从而保护细胞免受氧化损伤。最终，在荧光显微镜下观察到细胞ROS变化情况：正常情况下细胞ROS水平低，不易观察，DU暴露后细胞ROS显著上升，荧光显微镜视野下清楚观察到ROS情况，饥饿素有效降低DU暴露后细胞内ROS水平，并且随着饥饿素浓度升高ROS水平不断降低。饥饿素显著降低DU中毒后细胞氧化应激，使细胞减少氧化损伤。

综上所述，饥饿素有效提高DU暴露后MC3T3-E1细胞的存活率，降低细胞ROS水平减缓细胞氧化应激，调节OPG/RANKL系统及骨代谢，降低骨损伤，起到显著保护作用。

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(编辑：左艳芳)

Protective role of ghrelin in depleted uranium-induced damage of MC3T3-E1 cells

HAO Yu-hui,HUANG Jia-wei,LIU Cong,LI Rong

(Institute of Combined Injury,College of Preventive Medicine,Third Military Medical University,Chongqing 400038,China)

Abstract:ObjectiveTo evaluate the impact of ghrelin on depleted uranium (DU)-induced damage of the osteoblast MC3T3-E1. MethodsMC3T3-E1 cells were treated with different doses of ghrelin for 1 h before DU (500 μM) treatment. After 24 hours,the cell viability,intracellular tartrate-resistant acid phosphatase (StrACP),alkaline phosphatase (AKP),osteoprotegerin (OPG),solvable receptor activator of nuclear factor-κB ligand (sRANKL),catalase (CAT) and reactive oxygen species (ROS) were measured. ResultsAfter DU exposure,ghrelin pretreatment increased the cell viability and CAT levels,and reduced intracellular StrACP,AKP,sRANKL/OPG and ROS in a dose-dependent manner. ConclusionThrough maintaining the balance of OPG/RANKL and reducing the oxidative stress,ghrelin could protect against DU-induced damage of MC3T3-E1 cells.

Keywords:ghrelin;depleted uranium;osteoblast;reactive oxygen species

[中图分类号]R827.3

[文献标识码]A

[文章编号]1672-5042(2015)06-0595-04

[收稿日期]2015-03-05[修回日期] 2015-06-15

[基金项目]“十二五”国家科技支撑计划项目(2013BAK03B05-02)；国家自然科学基金面上项目(81472913)；国家重点实验室自主研究课题(SKLZZ201503)

doi:10.11659/jjssx.03E015064