乙酰地蒽酚软膏在小型猪皮肤的急性毒性研究

李烨 张晶璇 田璐 李慧 王江雪 李成合 魏金锋 靳洪涛 王爱平

实验研究

乙酰地蒽酚软膏在小型猪皮肤的急性毒性研究

李烨 张晶璇 田璐 李慧 王江雪 李成合 魏金锋 靳洪涛 王爱平

目的进行乙酰地蒽酚软膏在小型猪皮肤的急性毒性试验, 为乙酰地蒽酚软膏进行长期毒性剂量设计和对临床安全用药提供参考信息。方法8只普通级巴马小型猪, 分为四组, 分别为正常皮肤对照组、破损皮肤对照组、正常皮肤给药组、破损皮肤给药组, 每组2例, 且每组雌雄各半, 除常规指标外, 对其进行体温、血液生化、心电图等指标的观察。结果与对照组比较, 正常皮肤给药后皮肤刺激性较轻, 主要为皮肤发红；破损皮肤给药后皮肤刺激性较重, 可见发红、发黑等, 上述刺激性可自行好转或恢复。血液生化指标可见一定的伴随性改变。结论乙酰地蒽酚软膏急性毒性实验中小型猪破损皮肤对照组刺激性较正常皮肤给药组明显, 但均有较好的可逆性。

乙酰地蒽酚软膏；急性毒性；小型猪；皮肤刺激

银屑病(俗称牛皮癣、白疕)是一种常见的慢性、复发性、炎症性皮肤病, 皮损特点是表皮增生和脱屑, 严重影响患者生活质量。一般可分为寻常型、脓疱型、关节病型及红皮病型四种类型[1]。寻常型银屑病的皮损特点是表皮增生和脱屑,临床症状为：云母状鳞屑、刮除鳞屑的“半透明薄膜”现象、瘙痒等, 确切病因和发病机制尚不清楚[2]。地蒽酚系治疗银屑病的经典药物, 乙酰地蒽酚软膏系由乙酰地蒽酚、氧化锌、水杨酸、升华硫加基础凡士林组成。外用通过抑制酶代谢,降低增生表皮的有丝分裂活动, 使表皮细胞生成速度和皮肤角化速度恢复正常, 缩小和消退皮损, 用于治疗寻常型银屑病, 但有皮肤刺激性等不良反应[3]。为了进行长期毒性剂量设计和对临床安全用药提供参考信息, 参照国家食品药品监督管理总局《化学药物急性毒性试验技术指导原则》及《化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》进行实验设计对其在小型猪皮肤上进行急性毒性研究[4-6]。

1 材料与方法

1.1 受试物 乙酰地蒽酚软膏为山东省皮肤病性病防治研究所研制的经皮肤涂抹治疗银屑病的软膏。黄色软膏, 颜色均匀。在溶液中遇光线不稳定, 应尽量避光操作。对照物白凡士林, 白色膏状物, 无臭, 批号20110325, 标示量12％, 纯度100.2％。避光密封于阴凉处保存。

1.2 实验动物和饲养环境 普通级巴马小型猪,6～8个月龄, 体重10～13 kg。实验室温度16～26℃, 相对湿度40％～70％。试验所用动物及相关处置符合动物福利要求, 开展前经过实验动物管理和使用委员会(IACUC)的审查批准。

1.3 主要仪器 赛多利斯BWS-502F-150型台秤；欧姆龙体温计；光电ECG-9130P心电图机；MEK-7222K全自动五分类血液分析仪；OLYMPUS显微镜；SELECTRA-E全自动生化分析仪；AVL9181电解质分析仪。

1.4 试验方法

1.4.1 剂量与分组 实验设四个组, 每组2只, 雌雄各半,分别为正常皮肤对照组、破损皮肤对照组, 均涂抹凡士林；正常皮肤给药组、破损皮肤给药组, 均涂抹12％乙酰地蒽酚软膏, 约相当于人临床用药最大浓度10倍给药量。各组剂量及其与临床拟用剂量倍数的关系见表1。

1.4.2 给药方法 给药前24 h用电动除毛器去除动物脊柱两侧背毛, 去毛范围约25 cm×25 cm, 用纱布擦洗干净。破损皮肤制备：用细砂纸打磨皮肤, 以轻微渗血为度。单次给药,16 g/只供试品均匀涂在20 cm×20 cm脱毛区, 硫酸纸覆盖加专用固定带固定, 给药24 h后用温肥皂水去除残留的受试物。

1.5 观察指标及检测方法

1.5.1 临床症状观察 给药4 h内严密观察动物对供试品的反应。详细记录动物毒性反应情况, 中毒症状、中毒发生时间、持续时间、恢复时间及动物死亡时间和死亡动物数,死亡动物及时尸检, 存活24 h以上动物的肉眼观察到的病变组织、器官均需进一步作病理检查。观察期结束时存活动物处死并剖检, 异常组织器官进一步做组织病理学检查。每天观察1次, 连续观察14 d。

1.5.2 给药部位观察 观察给药部位有无出血、发红及颜色变化、肿胀、硬结、化脓、坏死。每天观察1次, 连续观察14 d。

1.5.3 体重体温测定 分别为给药前、给药后第7天和给药后第14天, 共3次。

1.5.4 心电图检查 分别为给药前、给药后第7天和给药后第14天, 共3次。计算以下指标：心率、PR间期、QT间期、QRS间期。

1.5.5 血液学及血清生化检查 给药前、给药后第7天和给药后第14天, 共3次。采血前1 d下午开始禁食不禁水。采血时不麻醉, 经前腔静脉采血。血液学检查采血量约1 ml,血清生化检查采血量约5 ml, 血液学检查使用MEK-7222K全自动五分类血液分析仪检测, 测定项目包括红细胞(RBC)计数、血红蛋白(HGB)、白细胞(WBC)计数、中性粒细胞(NEUT)百分比、淋巴细胞(LYM)百分比等。血清生化检查使用SELECTRA-E全自动生化分析仪, 测定项目包括丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、γ-谷氨酰基转移酶(GGT)、尿素(UREA)、尿酸(UA)等。

1.5.6 剖检及组织病理学检查 全部预定解剖的动物, 肌内注射2％戊巴比妥钠进行麻醉(麻醉剂量为35 mg/kg)。对动物局部(皮肤, 连带皮下肌肉组织)给药及肉眼观察异常组织进行组织病理学检查。10％中性甲醛固定, 经修块取材,逐级酒精脱水, 石蜡包埋, 滑动切片机切片, 经苏木素-伊红(HE)染色, 光镜下检查。

1.6 统计与分析 确定注剂量下的动物毒性反应, 并结合动物体温、血液学、心电图指标等对受试药的毒性进行综合分析。

2 结果

观察结果如下。

2.1 临床症状观察 正常皮肤对照组小型猪给药当天及药后笼旁观察未见异常。破损皮肤对照组动物破损皮肤发红,持续至药后D4, D5红色减退, D6皮肤外观恢复正常。正常皮肤给药组动物给药当日皮肤未见明显异常, 药后D2给药处皮肤略黑且发红持续至D5, 此后发红症状明显好转至正常。破损皮肤给药组动物给药当天皮肤发红发黑且伴有红斑及皮肤溃烂现象, D2起给药处皮肤发黑, 发红面积增大、颜色较深, D4起症状减轻, D6观察到动物略有抽搐现象, D7起恢复正常。

2.2 对动物体重、体温的影响 正常和破损皮肤给药组与对照组相比药前、药后体重未见明显异常, 破损皮肤给药组动物D7体温药后高于药前, 提示此期间动物可能由于皮肤反应而产生轻微炎症致体温升高。见表2。

2.3 对动物血液学、生化和电解质指标的影响 给药D7正常皮肤给药组与对照组相比WBC数量增多, 提示此期间内可能有过敏反应；破损皮肤给药组药后D7、D14与药前相比, RBC、血红蛋白及浓度(HGB、MCHC)以及血小板数量(PLT)增多提示有组织炎症；给药组D7与药前相比, LYM有减少趋势, 可能动物在此阶段免疫系统受到轻微攻击, 但在随后D14又恢复正常；给药组NEUT D7与药前相比显著增高, 推测是由局部炎症和轻微过敏反应所导致的。见表3。从生化AST、ALT、GGT等指标来看, 药物对动物的肝脏功能没有明显影响。D7与药前相比, 给药组的尿酸值显著增高, 可能与动物的炎症反应有关。见表4。与对照组比较及药前自身比较, 给药组动物药后电解质指标变化未见明显异常。

表1 小型猪(正常和破损皮肤)给予乙酰地蒽酚软膏急性毒性试验分组及剂量设计

表2 体重体温变化动物记录

表3 不同时间点动物个体血液学指标变化

表4 不同时间点动物个体生化指标变化

2.4 对动物心电图指标的影响 与对照组比较及药前自身比较, 给药组动物药后心电图指标心率、PR间期、QRS时限、QT间期变化未见明显变化。

2.5 大体解剖观察及组织病理学检查 药后第15天小型猪麻醉后解剖进行大体观察, 未见异常。取破损及给药部位进行组织病理学检查, 给药组织动物皮下可见轻度水肿, 皮下偶见吞噬棕黄色颗粒的巨噬细胞。

3 讨论

本品临床给药途径为皮肤给药, 由于小型猪皮肤在解剖学和生物学方面与人类皮肤相近, 且遗传背景清楚, 故选用该动物进行试验, 符合国家食品药品监督管理总局《化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》中关于皮肤刺激性的动物选择要求。因为银屑病的临床患者皮肤可呈正常态也可由于脱屑或瘙痒经患者抓挠呈破损态, 因此试验采用了正常及破损皮肤进行比较, 根据指导原则将皮肤脱毛25 cm×25 cm, 并将药膏以临床10倍浓度均匀涂在20 cm×20 cm脱毛区域, 给药前用细砂纸打磨皮肤致轻微渗血, 以尽量模拟临床患者抓挠致皮肤破损状态, 从而更加准确的对其进行安全性评价。

试验的结果指标中除体重、体温、解剖学观察及病理检查等常见指标外, 还包含血液学、生化、电解质以及心电图指标, 这些指标在《指导原则》中并未要求, 但其在药物的评价方面皆能起到重要的提示和参考作用：血液学多个指标显示药物作用于动物后产生炎症反应, 提示药物对皮肤的刺激作用, 生化指标尿酸值升高也进一步印证了上述结论。但是发生变化的指标大多都在观察结束时归于正常水平, 说明刺激作用轻微, 可自行恢复。与对照组比较及药前自身比较,给药组动物药后电解质及心电图指标变化未见明显异常。

试验中乙酰地蒽酚软膏的给药量为临床用药最大浓度的10倍, 经各项指标显示其对破损皮肤有轻微刺激性, 使用较安全, 为临床的安全使用提供了依据。同时伴有血液学及生化各项指标的观察及检查方法也为此类研究提供了新的皮肤刺激性的验证思路。

[1]张建中. 银屑病的流行病学与危险因素.实用医院临床杂志,2013,10(1):4-6.

[2]杨宗学, 陈丽, 姜林芹, 等. 复方地蒽酚软膏的临床研究. 东南国防医药,2012,14(2):117-119.

[3]王庆利, 张凤琴, 赵德恒. FDA发布经皮仿制药对皮肤刺激性和过敏性临床试验的设计及评分系统. 中国临床药理学杂志,2004,20(6):459-461.

[4]王振超, 黄壮雄, 许建鹏, 等. 复方丙酸氯倍他索乳膏对小型猪皮肤长程涂布的毒性观察. 广东医学院学报,2004,22(6):563-565.

[5]张宗保. 复方祛白喷雾剂的皮肤毒性和安全性研究. 中国药业,2014,23(18):24-26.

[6]韦宝伟, 刘布鸣, 陈力力, 等. 复方苯佐卡因凝胶的局部毒性研究. 国际口腔医学杂志,2012,39(1):10-11.

Acute toxicity research of acetyl dithranol ointment on skin of miniature pig

LI Ye, ZHANG Jing-xuan, TIAN Lu, et al. Institute of Materia Medica of Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing100050, China

ObjectiveTo make acute toxicity research of acetyl dithranol ointment on skin of miniature pig, in order to provide reference for long-term toxic dose design and clinical safe drug use of acetyl dithranol ointment.MethodsA total of8 general miniature pigs were divided into four groups as normal skin control group, damaged skin control group, normal skin medicine group and damaged medicine group, and each group contained2 cases with male and female. Observations were made on conventional indexes, body temperature, blood biochemistry, and electrocardiogram.ResultsCompared with the control group, normal skin medicine group had slighter skin irritation as rubefaction, while the damaged skin medicine group had more severe skin irritation as rubefaction and nigrescence. They were self-restored and retrievable. Certain of concomitant changes were shown in blood biochemical index.ConclusionSkin irritation of damage skin medicine group is more obvious than that of normal skin medicine group in the acute toxicity research of acetyl dithranol ointment on miniature pig, but they all have good reversibility.

Acetyl dithranol ointment; Acute toxicity; Miniature pig; Skin irritation

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.07.196

2014-12-25]

国家科技重大专项重大新药创制基金(项目编号：2012ZX09301002-001-009,2013ZX09302302)

100050 中国医学科学院药物研究所/北京协和医学院新药安全评价研究中心(李烨 张晶璇 田璐 李慧 王江雪

李成合 魏金锋 靳洪涛 王爱平)；北京协和建昊医药技术开发有限责任公司(张晶璇 田璐 李慧 王江雪 李成合 魏金锋靳洪涛 王爱平)

靳洪涛