琼枝麒麟菜多糖抗呼吸道病毒活性研究

邹沐平, 董 栋 王怀玲 王巧利 蒲含林, 王一飞

(1. 暨南大学 生命科学技术学院 生物医药研究开发基地, 广东 广州 510632; 2. 暨南大学 生命科学技术学院 生物工程研究所, 广东 广州 510632)

琼枝麒麟菜多糖抗呼吸道病毒活性研究

邹沐平1,2, 董 栋1, 王怀玲1, 王巧利1, 蒲含林2, 王一飞1

(1. 暨南大学 生命科学技术学院 生物医药研究开发基地, 广东 广州 510632; 2. 暨南大学 生命科学技术学院 生物工程研究所, 广东 广州 510632)

为了评价琼枝麒麟菜多糖(EGP)包括粗提物(CEGP)及大于500 kDa多糖组分(LEGP)抗呼吸道相关病毒活性。采用Reed-muench法计算流感病毒H1N1、H3N2和H5N3, 柯萨奇病毒CVB3及呼吸道合胞病毒RSV-long株滴度; 采用观察细胞病变效应(CPE)法, 确定CEGP和LEGP对犬肾细胞(MDCK),人宫颈癌细胞(HeLa)和人喉癌上皮细胞(HEp-2)的最大无毒浓度; 通过细胞病变观察法(CPE)及四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)测定CEGP和LEGP抑制各病毒产生细胞病变的作用。结果表明: CEGP和LEGP对5种常见的呼吸道病毒H1N1、H3N2和H5N3, CVB3和RSV都有抑制作用, CVB3和RSV对CEGP和LEGP更敏感; CEGP和LEGP有抗多种呼吸道病毒作用, 为抗呼吸道病毒新药的研发提供理论依据。

琼枝麒麟菜多糖; 抗病毒; 呼吸道病毒

呼吸道病毒是一类能侵犯呼吸道或以呼吸道为侵入门户而引起呼吸道及呼吸道外组织器官病变的病毒[1]。呼吸道病毒包括流感病毒(H1N1, H3N2, H5N3等)、呼吸道合胞病毒(RSV)和科萨奇病毒(CVB3)等。流感病毒传染性极强且极易变异, 危害性大, 难以控制[2], 目前广泛使用的抗流感病毒的西药具有一定的毒副作用, 并可引起流感病毒变异, 或产生不同程度的耐药性[3]。柯萨奇病毒CVB3是非常严重的致病病原[4-5], 目前尚无有效药物[6]。呼吸道合胞病毒RSV可引起婴幼儿严重呼吸道感染, 目前只有病毒唑和RSV免疫球蛋白2种药物。但病毒唑不良反应较严重, RSV免疫球蛋白治疗费用很高。综上, 呼吸道病毒对人类危害大, 人类尚无法阻止这些病毒感染或进行有效治疗, 因此, 开发研制药效可靠, 毒副作用小的新药, 仍然是国际新药研发的重要任务。

近年来对海洋资源的开发成为热点, 目前国内外对海洋生物活性物质的研究都取得一定进展。许多从海洋生物中提取的天然产物具有抗肿瘤, 抗凝血, 抗病毒[7-8]等的生物活性。从海洋生物中提取的多糖, 尤其是从海藻中提取的硫酸酯多糖, 不仅能提高机体免疫力, 而且具有广泛的抗病毒作用[9]。

琼枝麒麟菜(Eucheuma gelatinae)属于红藻门,麒麟菜属, 在我国海南岛有大规模的人工养殖, 资源十分丰富[10]。麒麟菜中含有丰富的多糖, 约占藻体干重的60%。迄今为止, 人们对琼枝麒麟菜在抗病毒等生物活性方面的研究较少。本文对琼枝麒麟菜多糖粗提物(CEGP)及大于500 kDa多糖组分(LEGP)抗呼吸道相关病毒活性进行初步研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 病毒

流感病毒H1N1、H3N2和H5N3, 呼吸道合胞病毒RSV-long株和柯萨奇病毒CVB3均为本实验室保存。

1.1.2 细胞

犬肾细胞(MDCK), 人宫颈癌细胞(HeLa)和人喉癌上皮细胞(HEp-2), 均为本实验室保存。

1.1.3 药物

参考王怀玲等[11]多糖提取工艺, 通过水提醇沉法得到琼脂麒麟菜粗多糖(CEGP), 并通过膜分离技术从琼枝麒麟菜粗多糖中分离出大于 500 kDa的多糖组分(LEGP)。所有样品均没有检测出核酸及蛋白质等杂质。

1.1.4 试剂与器材

胎牛血清, 杭州四季青生物材料工程有限公司;二甲基亚砜, 广州化学试剂厂; DMEM培养基, Gibco公司; MEM 培养基, Gibco公司; 培养箱, 日本SANYO公司; 96孔培养板, 美国 CORNING公司;倒置显微镜, 德国 Leica公司; 超净工作台, 苏州净化设备公司。

1.2 实验方法

1.2.1 病毒毒力测定[12]

选用MDCK、HeLa和HEp-2细胞进行培养。接种1.5×105个/mL细胞于96孔细胞培养板, 在恒温培养箱中培养16～20 h, 待细胞生长成单层后, 吸弃培养基, 用PBS洗涤3次, 加入用维持液按10倍递减稀释的病毒毒液100 μL/孔, 设8个复孔, 同时设正常细胞对照。37℃, 5% CO2温箱中培养3 d, 在倒置显微镜下观察并记录细胞形态变化(CPE), 细胞无病变为–, 病变 0～25%为+, 病变 25%～50%为++, 病变50%～75%为+++, 病变75%～100%为++++。根据观察结果用Kärber 公式计算TCID50。

1.2.2 细胞毒性实验

选用MDCK、HeLa和HEp-2细胞进行培养。对CEGP和LEGP的细胞毒性进行测定, 计算最大无毒剂量(TC0)。细胞长成单层后, 吸弃培养液, 分别加入维持液按2倍比稀释成不同浓度的药液, 每孔100 μL,各设6个复孔, 同时设正常细胞对照, 其间置倒置显微镜下观察, 采用 CPE法[10], 观察药物的最大无毒浓度TC0。

1.2.3 抗呼吸道相关病毒活性[13]

选用MDCK、HeLa和HEp-2细胞进行培养。在96孔培养板中接种细胞密度为1.5×105个/mL, 每孔100 μL, 37℃, 5% CO2培养箱中培养16～20 h, 待其生长为单层细胞, 弃去培养液, 用PBS洗3次, 将不同稀释度的药物(在无毒浓度范围内)和病毒稀释液(100TCID50)各 50 μL直接加到单层细胞上, 先加样品液, 再加病毒液。每个浓度设3个复孔, 100 μL/孔,同时设病毒对照组、正常细胞对照组, 置于 37℃、5% CO2培养箱培养24～72 h, 其间置倒置显微镜下观察细胞病变(CPE)的情况。待病毒对照组的细胞病变达到 75%以上, 而对照组细胞正常时, 观察并记录各孔的CPE, 并做MTT定量活细胞数计算病毒抑制率。

病毒抑制率=(药物组吸光度–病毒组吸光度)/(对照组吸光度–病毒组吸光度)×100%。

根据病毒抑制率计算药物的半数抑制浓度(IC50)和药物的治疗指数TI= TC50/ IC50。

1.2.4 麒麟菜多糖样品抗病毒机理初探

LEGP虽然是 CEGP进一步精制所得, 但是抗病毒活性与 CEGP相似, 且没有明显提高, 为以后产业化工艺成本考虑, 选用CEGP进行机制研究。根据1.2.3的实验结果, 选取CEGP抗病毒活性较好的两株病毒进行抗病毒机理的初步探索。按不同给药途径设置三组实验: a. 感染病毒前加药法。将CEGP用维持液对倍稀释后加入长成单层的Hela细胞, 每孔 50 μL。37℃吸附两小时后加入 50 μL CVB3病毒悬液。b. 直接灭活法。将CEGP用维持液对倍稀释后与相同体积的 CVB3病毒悬液混合,在37℃孵育2 h后加入单层Hela细胞。c. 感染病毒后加药法。接种50 μL病毒悬液于单层细胞中, 在37℃吸附1 h后加入用维持液对倍稀释的CEGP溶液[11]。所有96孔培养板均置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养, CPE观察, 待病毒对照孔达到 75%以上病变程度时, 用 MTT法定量活细胞数计算病毒抑制率, 方法如1.2.3。

2 结果

2.1 病毒滴度测定

通过倒置显微镜观察细胞病变情况, Reedmuench方法计算各毒株TCID50(表1)。以100TCID50的浓度进行抗病毒实验。

表1 实验所用各毒株滴度Tab.1 Virus titer used in the experiment

2.2 CEGP和LEGP对各细胞株的细胞毒性测定

以正常细胞无死亡、不引起细胞病变的最高药物稀释浓度作为对各株细胞的最大无毒浓度 TC0, CPE观察结果见表2。

CPE观察结果得, CEGP和LEGP在实验所用浓度(≤500 μg/mL)范围对MDCK, HeLa, HEp-2细胞均无毒。

表2 CEGP和LEGP的细胞毒性Tab.2 Cytotoxicity of CEGP and LEGP

2.3 CEGP和LEGP对呼吸道相关病毒的作用

倒置显微镜下观察, 流感病毒感染使细胞出现破碎、皱缩成团等病变特征(如图 1b); 科萨奇病毒CVB3感染使细胞皱缩、变圆死亡(如图2b); 呼吸道合胞病毒 RSV感染导致细胞出现典型的合胞体(如图3b)。CEGP及LEGP在实验所用浓度(≤500 μg/mL),均能不同程度地抑制各株病毒感染所致的细胞病变(如表3所示), 且CEGP和LEGP的作用相似。病毒RSV和CVB3均比三株流感病毒对CEGP 和LEGP更敏感, 最低浓度31.25 μg/mL的CEGP 和LEGP可100%抑制病毒 RSV引起的细胞病变, 而最低浓度62.5 μg/mL 的 CEGP和 LEGP可 100%抑制病毒CVB3引起的细胞病变。抗病毒活性及治疗指数结果(表 4)显示 CEGP对科萨奇病毒的半数治疗指数为0.371 μg/mL, LEGP对科萨奇病毒的半数治疗指数为0.263 μg/mL, 治疗指数分别是大于1347及1901。

图1 显微镜下MDCK细胞形态: 正常细胞(a), 流感病毒感染后(b)和流感病毒 + CEGP(c)Fig.1 MDCK cells under the microscope: normal cells (a), cells infected with the influenza virus (b), cells infected with the virus but treated with CEGP (c)

图2 显微镜下HeLa细胞形态: 正常细胞(a), 感染后(b)和+CEGP(c)Fig.2 Hela cells under the microscope: normal cells (a), cells infected with CVB3 (b), cells infected with the virus but treated with CEGP (c)

图3 显微镜下HEp-2细胞形态: 正常细胞(a), 感染后(b)和+CEGP(c)Fig.3 HEp-2 cells under the microscope: normal cells (a), cells infected with RSV (b), cells infected with the virus but treated with CEGP (c)

表3 CEGP和LEGP抗呼吸道相关病毒活性(CPE)Tab.3 Anti-respirovirus activity of CEGP and LEGP (CPE)

表4 CEGP和LEGP的抗病毒活性及治疗指数Tab.4 Antiviral activity and the therapeutic index of CEGP and LEGP

待病毒对照孔病变达到 75%以上而且病变不再随时间增加而变化时, 用MTT法检测各孔中细胞存活率。结果如图4和图5, CEGP和LEGP的抗病毒活性都呈浓度依赖性, 且高浓度对病毒抑制率更高。

图4 CEGP对实验中各株病毒抑制作用的效量关系Fig.4 Inhibition effect of the virus (CEGP)

2.4 麒麟菜多糖样品抗病毒机理初探

根据2.3的实验结果, 选取抗病毒活性较好的两株病毒RSV和CVB3进行抗病毒机理的初步研究。不同给药途径下CEGP的抗病毒活性见图6及图7。

由图 6和图 7知, 不同给药途径下 CEGP对CVB3和 RSV两种病毒的抑制效果一致, 都是先加药后感染病毒＞直接灭活＞感染病毒后加药。这说明CEGP具有良好的抑制病毒吸附或侵入细胞的活性,在细胞外也能有效地直接杀灭病毒。

图5 LEGP对各病毒株感染细胞抑制作用的效量关系Fig.5 Inhibition effect of the virus (LEGP)

图6 不同给药途径下CEGP的抗CVB3活性Fig.6 Antiviral activity against CVB3 of CEGP based on different dosing

图7 不同给药途径下CEGP的抗RSV活性Fig.7 Antiviral activity against RSV of CEGP based on different dosing

3 讨论

本文初步研究了麒麟菜多糖的抗病毒活性, MTT及CPE结果显示, CEGP及LEGP对常见的呼吸道病毒包括流感病毒(H1N1, H3N2, H5N3), 科萨奇病毒CVB3及呼吸道合胞病毒RSV都具有一定抗病毒活性, 且活性相似, 证明抗病毒多糖成分为大分子量多糖组分。并且, 随着CEGP和LEGP浓度增大, 抗病毒活性也随之增强。其中, LEGP对CVB3的作用最好, 治疗指数TI高达1901, 但其抗呼吸道相关病毒活性具体作用机制还有待进一步研究。另外, 在实验所用浓度范围内(＜500 μg/mL), CEGP及LEGP对MDCK、HeLa和HEp-2细胞均无明显毒性。不同给药途径下 CEGP的抗病毒作用实验证明, CEGP是通过阻止病毒吸附或侵入细胞以及直接杀灭病毒来保护细胞免受病毒感染。关于 CEGP是直接抑制病毒吸附于细胞上还是抑制了病毒核酸注入细胞的过程, 以及是通过哪种方式杀伤病毒, 相关机制正在进一步研究中。

本文研究并证明了CEGP及LEGP具有抗呼吸道相关病毒活性并初步探讨了抗病毒作用机制, 可针对该活性做进一步的体内研究, 开发出可以预防及治疗呼吸道相关疾病的药物或医疗器械等。麒麟菜易于大规模人工培养, 藻体多糖含量高达 60%, 来源十分丰富, 为其进一步的开发提供了有利的基础。

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Conclusion: CEGP and LEGP showed great potential in respirovirus inhibition.

(本文编辑: 康亦兼)

Anti-respirovirus activity of aEucheuma gelatinaepolysaccharide

ZOU Mu-ping1,2, DONG Dong1, WANG Huai-ling1, WANG Qiao-li1, PU Han-lin2, WANG Yi-fei1
(1. Guangzhou Jinan Biomedicine Research and Development Center, Guangzhou 510632, China; 2. Guangzhou Jinan Bioengineering Institute, Guangzhou 510632, China)

Nov., 28, 2014

Eucheuma gelatinaepolysaccharides; antiviral activity; respirovirus

Objective: To evaluate the anti-respirovirus effects of crudeEucheuma gelatinaepolysaccharides (CEGP) and large molecular weight components (MW ＞ 500 kDa, LEGP). Method: The Reed-Muench method was used to calculate the titer of the influenza virus (H1N1, H5N3, and H3N2), coxsackie virus (CVB3), and the respiratory syncytial virus (RSV-long). The maximum no toxicity concentrations of CEGP and LEGP to each cell line (MDCK, HeLa, and HEp-2) were selected by the cytopathic effect (CPE) method. The antiviral effects of CEGP and LEGP were evaluated by the MTT and CPE methods. Results: Both CEGP and LEGP showed significant and similar inhibition effects on the influenza virus (H1N1, H5N3, and H3N2), CVB3, and RSV-long. CVB3 and RSV were more sensitive to EGP (CEGP and LEGP) compared with the influenza virus.

Q

A

1000-3096(2015)12-0015-06

10.11759/hykx20141128001

2014-11-28;

2015-06-05

广东省海洋渔业科技推广专项科技攻关与研发(A201301C06)资助

邹沐平(1990), 女, 广东揭阳人, 硕士研究生; 研究方向:海洋药物, 电话: 15002004602, E-mail: zoumuping@163.com; 王一飞,通信作者, 教授, 研究方向: 生物医药, 电话: 020-85223426, E-mail: twangyf@jnu.edu.cn; 蒲含林, 通信作者, 男, 副研究员, 研究方向: 天然产物纯化、合成及活性研究, 电话: 13560136797, E-mail: tphl@jnu.edu.cn