毛菊苣有效部位降脂作用及初步机制探讨

姚红锐，龙子江，赵　刚 ，杨　燕 ，江　震

(1.安徽中医药大学第一附属医院药学部，安徽 合肥　230031;2.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥　230012)



毛菊苣有效部位降脂作用及初步机制探讨

姚红锐1，龙子江2，赵刚1，杨燕1，江震1

(1.安徽中医药大学第一附属医院药学部，安徽 合肥230031;2.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥230012)

摘要：目的在整体水平上，研究毛菊苣有效部位含药血清降脂作用及初步机制 。方法利用MTT法确定血清的加入量以及尼罗红染色建立HepG2细胞高脂模型，在此基础上，检测细胞内的关键性指标甘油三酯(TG)和脂滴的含量,最后通过ELISA酶联免疫吸附法分别从游离脂肪酸的吸收、氧化、TG 的合成方面对毛菊苣降脂有效部位含药血清的降脂机制进行初步的探讨。结果通过MTT实验和尼罗红染色及流式定量分析表明，脂肪乳浓度为总体积的 6%时，造模组细胞内的脂滴含量较正常对照组明显增加，具有显著性差异(P<0.01、0.001)；不同模型的大鼠含药血清均可显著性地降低HepG2细胞内TG(P<0.05)和脂滴(P<0.01、0.001)的含量，并且正常状态下的含药血清比病理状态下的含药血清降脂效果显著；同时对TG合成、氧化、吸收通路中的关键酶GPAT1-2(P<0.05)、PPARγ(P<0.05 、0.01)、FATP5(P<0.01)三个指标上的检测表明正常状态下的含药血清与高脂模型组相比具有显著性差异。 结论大鼠病理状态下(高脂模型)与正常生理状态下的毛菊苣降脂有效部位含药血清具有显著性地降低人肝癌HepG2细胞高脂模型的作用，并且后者较前者降脂效果明显，其机制可能与减少GPAT1-2的含量、促进PPARγ的表达和抑制FATP5的生成有关。

关键词：毛菊苣；有效部位；含药血清；降脂作用；初步机制

传统维吾尔医用菊苣属植物毛菊苣(CichoriumglundulosumBoissetHout)，在临床上主要用于抗肝炎等作用，研究表明其在降脂方面亦有明显的疗效[1]。甘油三酯(TG) 和细胞内脂滴含量的多少直接反映了机体内脂质水平的高低。已知甘油脂类合成主要受线粒体外膜上的 GPAT1-2(mtGPAT )催化。研究发现过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)能够增强脂肪酸的氧化和利用。在机体当中，还存在着另一类与游离脂肪酸吸收高度相关的蛋白，游离脂肪酸转运蛋白(FATP5)，可特异性地介导脂肪酸的跨膜转运。

因此，本文从整体水平上探讨毛菊苣的降脂有效部位中潜在活性物质及其代谢产物的降脂作用[2-3],研究大鼠病理状态下(高脂模型)与正常生理状态下的毛菊苣降脂有效部位含药血清对人肝癌HepG2细胞高脂模型的降脂作用，并且对这两种血清降脂作用进行比较。同时分别从游离脂肪酸的吸收，氧化，TG 的合成方面，对毛菊苣降脂有效部位含药血清的降脂机制进行初步的探讨[4-5]。

1材料

1.1细胞人肝肿瘤细胞系 HepG2(ATCC)购自中科院上海药物研究所。

1.2药品与试剂毛菊苣有效部位物含药血清(95%乙酸乙酯提取)[6]；尼罗红(Sigma)；甘油三酯试剂盒(南京建成生物有限公司)；20%脂肪乳注射液(三菱制药有限公司)；四甲基偶氮唑蓝(MTT)；线粒体提取试剂盒(北京索宝来公司)；PPARγ、GPAT1-2、CD36、FATP5 ELISA 试剂盒(武汉优尔生物技术有限公司)；高脂饲料(江苏省协同医药生物工程有限责任公司)。

2方法

2.1MTT法确定血清加入量将 HepG2细胞以每孔8 000个的数目加入 96 孔板中，贴壁培养 24 h，随后更换无血清培养基，同时分别加入不同体积的大鼠溶剂对照组血清，使其含量占总培养基的 5%、10%、20%、40%、60%。继续培养 24 h 后，加入 20 μL MTT，培养 4 h，取出孔内所有液体，加入 150 μL DMSO，振摇 8～10 min，待颜色稳定后，于510 nm处测定各孔吸光值，取平均值进行计算。

2.2细胞高脂模型的建立[7]取对数生长期的 HepG2细胞，以每孔 2×104的数目加入到 24 孔板当中，培养 24 h，待 HepG2细胞长到 60%～70% 时，加入脂肪乳注射液，使其终浓度分别为 0、2%、4%、6%、8%(v/v)，同时更换成无血清培养基。细胞培养 24 h 后弃上清液，清洗加入尼罗红染色液，室温避光染色 5 min，PBS 洗涤 2 次，可直接在530～550 nm处通过荧光显微镜观察测定。

2.3GPO-POD法检测 HepG2细胞内 TG 的含量取对数生长期的 HepG2细胞，以每孔 1×105的数目加入到 6 孔板当中。细胞培养 24 h 后，弃上清，将细胞分为正常对照组、细胞高脂模型组，细胞高脂模型+各种含药血清组，取上清，部分上清用于 BCA 法进行蛋白定量，剩余上清根据 TG 试剂盒说明书进行 TG 含量的测定。

取对数生长期的 HepG2细胞，以每孔 1×105的数目加入到 6 孔板当中。细胞培养 24 h 后，弃上清，将细胞分为正常对照组、高脂模型组，高脂模型+各种含药血清组，用流式细胞仪检测各组细胞荧光强度值，取荧光强度几何中位值进行数据分析。降低率=(含药血清平均荧光强度-正常血清平均荧光强度)/ 含药血清平均荧光强度。

2.4ELISA 法检测大鼠肝细胞线粒体内GPAT1-2的含量大鼠组织样本处理后按照GPAT ELISA 试剂盒说明书操作，在酶标仪 450 nm处测 OD，15 min 内检测，确定包被 ELISA 孔的线粒体浓度。

2.5ELISA 法检测 HepG2细胞内PPARγ、FATP5的含量建立HepG2细胞高脂模型并给药，用 ELISA 法在 450 nm 波长测量各孔的光密度(OD 值)，计算各组 PPAPγ、FATP5 的含量。

3结果

3.1MTT法确定血清加入量对HepG2细胞增殖的影响根据图1结果，发现当大鼠溶剂对照组血清的加入量占培养基总量的 5%～20%时，不会抑制细胞的生长，故在以后的实验当中，选择血清药理学通法中建议的10%为大鼠血清的加入体积比。

3.2HepG2细胞高脂模型的建立根据图 2 结果，发现 HepG2细胞内的脂滴含量随着脂肪乳浓度的增加而增加，当脂肪乳浓度达到总体积的 8% 时，细胞形态发生变化，故选择 6%加入量为后续实验中 HepG2细胞高脂模型造模浓度。图3结果表明，在脂肪乳浓度为总体积的 6%时，造模组细胞内的 TG 含量较正常对照组明显增加，具有极显著差异(P<0.001 )。

A0%脂肪酸B2%脂肪酸C4%脂肪酸D6%脂肪酸E8%脂肪酸

图2尼罗红染色观察HepG2细胞中不同组别的脂滴含量(400×)

注：箭头所示为细胞的脂滴。

图3HepG2细胞中正常组和模型组甘油三酯

注：与正常组比较，**P<0.01 ，***P<0.001。

3.3大鼠含药血清对HepG2细胞高脂模型中TG含量的影响与同组溶剂对照血清相比，两种状态下的含药血清均能显著降低 HepG2细胞内 TG 的含量(P<0.05 )，并且正常状态下的含药血清比病理状态下的含药血清降脂效果稍强，但彼此没有显著性差异。见表1。

表1　大鼠含药血清对不同模型的HepG2细胞

注：与对照组比较，*P< 0.05。

3.4大鼠含药血清对HepG2细胞高脂模型中脂滴含量的影响与同组溶剂对照血清相比，两种状态下的含药血清均能显著降低细胞内的脂滴含量(P<0.01，P<0.001)，并且正常状态下的含药血清比病理状态下的含药血清的降脂滴作用更显著。见表2。

表2　大鼠含药血清对不同模型的HepG2 细胞

3.5大鼠含药血清对大鼠肝细胞线粒体内GPAT1-2含量的影响由图 4 得知，与线粒体模型组相比，阳性药 NEM 与两种状态下的含药血清均可以显著性的降低大鼠肝脏线粒体中的 GPAT1-2的含量(P<0.05)；正常组大鼠溶剂对照血清也可以显著的降低大鼠肝脏线粒体中 GPAT1-2的含量(P<0.05)，说明大鼠含药血清可明显减少肝线粒体内GPAT1-2的含量。

注：与模型组比较，*P< 0.05。

3.6大鼠含药血清对HepG2细胞高脂模型中PPARγ含量的影响结果见图5，与正常组比较，高脂模型组PPARγ含量显著降低(P<0.01)；与细胞高脂模型组相比，两种状态下的含药血清均可以显著性的升高 HepG2细胞高脂模型中 PPARγ 的含量(P<0.05、0.01)，说明大鼠含药血清可明显促进PPARγ含量的表达。

图5正常大鼠与高脂大鼠含药血清对PPARγ表达的

注：与正常组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3.7大鼠含药血清对HepG2细胞高脂模型中FATP 5含量的影响结果见图6，与正常组比较，高脂模型组FATP 5含量显著升高(P<0.01)；与细胞高脂模型组相比，两种状态下的含药血清均可以显著性的降低 HepG2 细胞高脂模型中FATP 5 的含量(P<0.01)，说明大鼠含药血清可明显地抑制FATP 5含量的表达。

注：与正常组比较，##P<0.01；与模型组比较，**P< 0.01。

4讨论

结果显示，在 TG 与细胞内脂滴这两种代表细胞内脂质含量的终点检测指标方面，正常状态下的含药血清比病理状态下的血清降脂效果略强，这可能表明病理状态下机体确实对含药血清当中的有效成分有一定程度消耗；由实验结果发现，高脂组含药血清也能明显的改善 HepG2细胞中脂质的蓄积，这说明在高脂组含药血清当中，也存在着一些由于药物刺激而产生的降脂活性物质[8-9]。

从 GPAT1-2、 PPARγ和 FATP5 这 3个与 TG 的合成、FFA的氧化和吸收有关的指标来看，两种状态下的血清都有明显的恢复作用，并且彼此之间没有差别，说明在一般情况下，两种模型的含药血清都可以进行血清药理学研究[10]。此外，在 GPAT1-2和 FATP5 这 2 个指标当中，发现溶剂对照组血清与模型组相比，也有明显的保护作用，说明血清内本身就含有多种生物活性因子，从而对机体起到一定的保护作用。

在本实验当中，发现毛菊苣降脂有效部位的含药血清能够降低细胞内脂质的含量，同时也能显著性的改善由于细胞高脂模型所引起的脂质代谢相关靶点的紊乱，说明毛菊苣降脂有效部位能够从整体上，多角度的调节脂类的生成与代谢，为毛菊苣的降脂物质基础以及作用机制的进一步研究提供一点依据[11-12]。

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Lipid-lowering effect of the effective parts of Cichorium glundulosum

and its preliminary mechanism

YAO Hong-rui1,LONG Zi-jiang2,ZHAO Gang1,et al

(1.DepartmentofPharmacy,TheFirstAffiliatedHospital,AnhuiUniversityofTraditionalChineseMedicine,

Hefei230031,China;2.DepartmentofPharmacy,AnhuiUniversityofTCM,Hefei230012,China)

Abstract:ObjectiveTo explore lipid-lowering effect of the effective parts of Cichorium glundulosum and its preliminary mechanism.MethodsMTT method was used to determine the amount of serum,as well as Nile red staining to establish hyperlipidemia model of HepG2cells.On this basis,the content of key index TG and the lipid droplets were determined.Finally,ELISA enzyme-linked immunosorbent assay was used to make a preliminary study of the lipid-lowering mechanism of Cichorium glundulosum effective parts from the aspects of the absorption,oxidation and TG synthesis of free fatty acid.ResultsIt was showed that,through MTT experiment and Nile red staining and the flow type quantitative analysis,fat drops content of module cell was obviously increased more than that of control group and had significant difference (P< 0.01 and 0.001) when fat breast concentration was 6% of the total volume;content of TG (P<0.05) and fat drops (P<0.01 and 0.001) of HepG2cells were significantly reduced in different models of rat,and medicated serum in normal state had more significant lipid-lowering effect than that in pathological state.And tests of the three indexes GPAT1-2(P<0.05),PPARγ (P<0.05 and 0.01),FATP5(P<0.01) showed that there was significant difference between medicated serum in normal state group and that in high lipid model group.ConclusionsMedicated serum with the effective parts of Cichorium glundulosum in pathological state (high lipid model) or in normal state can both significantly lower hyperlipidemia model of human hepatoma cell line HepG2cells and the latter had more significant lipid-lowering effect,the mechanism of which may be related to reducing the content of GPAT1-2,promoting the expression of PPARγ and inhibiting the FATP5 generation.

Key words:Cichorium glundulosum;effective parts;medicated serum;lipid-lowering effect;preliminary mechanism

(收稿日期：2015-05-30，修回日期：2015-07-20)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.10.006

通信作者：龙子江，男，教授，博士生导师，研究方向：中药及复方药理作用及机制研究，E-mail：942615693@qq.com

基金项目：安徽高校省级自然科学研究项目 (No KJ2014Z150)