柑橘中天然产物辛弗林的研究进展

张国友，邱 静，陈 刚，陈爱亮，赵 燕，徐贞贞，杨曙明

(中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所/农业部农产品质量安全重点实验室，北京 100081)

柑橘类水果是世界上产量最大的水果。中国是柑橘的主要原产国之一，有文字记载的栽培历史达4 000 多年［1］。中国柑橘的生产面积于2004 年达到163 万hm2，居世界第一位。近年来我国柑橘产量持续增长，产量于2011 年达2 750 万t，居世界第一位。

辛弗林作为柑橘重要的天然产物之一，被广泛使用于医药、食品、饮料、饲料和化妆品等行业中［2］。美国FDA 于2004 年禁止在膳食补充剂中添加麻黄碱之后，辛弗林作为替代品得到了更为广泛的应用。然而，有报道称辛弗林在心血管方面具有副作用甚至毒性［3-5］。加拿大卫生总署于2010 年建议辛弗林日服用剂量要小于30mg［4］。Kaats GR 等［6］为了确认辛弗林是否具有副作用需要进行长期临床研究。为了避免在农产品生产过程中辛弗林的误用以致引发食物安全事件，本文针对辛弗林的结构、来源、分布及检测技术的国内外研究进展进行综述。

1 辛弗林的结构、来源及分布

1.1 辛弗林的结构

1.1.1 异构体 辛弗林(Synephrine，C9H13NO2)是一种天然生物碱。目前发现的辛弗林异构体有3 种:para-synephrine (p-辛弗林)、meta-synephrine (m-辛弗林)和ortho-synephrine (o-辛弗林)。p-辛弗林是枳实等柑橘产品提取物的主要药用成分之一。o-辛弗林是通过人工合成产生的。关于m-辛弗林，有的学者认为，柑橘产品中含有m-辛弗林，而有的学者认为柑橘产品中没有m-辛弗林［3，7，8］。m-辛弗林和p-辛弗林具有不同的生物活性和药理特征，m-辛弗林的存在与否会直接影响辛弗林类产品的功效和食物的安全性。

1.1.2 对映体 辛弗林具有手性特征，含有两个对映体。不同的对映体在手性环境中的生物活性、毒理学、环境化学过程等存在较大的差异［9］。左旋—辛弗林与右旋—辛弗林，即(－)－辛弗林与(+)－辛弗林在药理活性上存在显著差异［7］。柑橘中辛弗林主要以(－)－辛弗林为主［10］，提取过程中，(－)－辛弗林受到温度、pH 值以及有机溶剂的影响会发生外消旋化［11］。重视辛弗林异构体和手性特征可以降低食物安全隐患。

1.2 辛弗林的来源与分布

辛弗林在芸香科植物酸橙及其栽培变种、甜橙的果皮、果实、果汁、果籽中均有分布，在芸香科植物吴茱萸中也有报道［3］。辛弗林的含量受到品种、产地以及生长期等因素的影响。不同品种柑橘落果中辛弗林的含量相差近20 倍［12］，同一植株柑橘皮中辛弗林的含量随着果实成熟度的增加而降低［14］。辛弗林可以通过对柑橘类产品的提取和纯化获得，也可以通过化学合成获得。化学合成的辛弗林是外消旋混合物，其药效远小于天然提取的辛弗林［15，16］。

1.3 辛弗林的功效

辛弗林作为枳实提取物的主要药用成分，被我国传统医学用于理气宽中、行滞消胀、食积不化等［17］。美国等西方国家将辛弗林用于制作减肥产品。辛弗林可刺激α-和β3肾上腺素受体，能提升能耗、血压、代谢、产热和减轻体重［3，7］。辛弗林与咖啡因、甲基黄嘌呤、麻黄碱、牛磺酸等合用时，对心血管和中枢神经的刺激作用加剧，会引发头痛、癫痫、中风甚至心力衰竭。辛弗林常以植物提取物的形式与其他有效成分混合而成，所以在其副作用方面还存在争议［3，5-7］。

2 辛弗林的检测技术

在柑橘中是否含有m-辛弗林以及在辛弗林的副作用方面存在争议，检测技术和方法的发展是正确认识辛弗林、深入理解其药理作用和进行质量控制的保障。

2.1 样品前处理

2.1.1 提取 溶剂提取法是常用的方法，乙醇或甲醇是最常用的溶剂，按操作可分冷浸法、渗流法和回流法，回流法提取效率较高［18］。连续回流法，即索氏提取法(SE)的提取效率高，操作方便，但是因提取液加热时间长而不适用于受热易分解的成分。Karsten Putzbach 等［19］比较了SE 法与声波提取法对酸橙类食品补充剂中的辛弗林等4 种生物碱的提取效率，发现声波提取法的提取效果比SE 法好。贺冬秀等［20］比较了超声波辅助提取法(UAE)与微波辅助提取法(MAE)对陈皮中辛弗林的提取效率，发现MAE 法更好。超临界流体提取法(SFE)节省溶剂而且可以在相对低温条件下完成提取，周鸣谦等［21，22］使用SFE-CO2萃取柑橘落果中的辛弗林，提取率达35.8%，萃取物中辛弗林含量为44.7%，远高于溶剂法萃取物(4.6%)，但是萃取压力高、耗时长导致操作成本相对较高，而采用超声强化SFE 法则可以进一步的提高提取效率。另外，Sun Yujing 等［23］比较了晒干、烘干和冻干对未熟柑橘落果中生物活性成分提取的影响，发现冻干方式有利于辛弗林的提取。

2.1.2 净化 常用的净化方法有有机溶剂萃取法、固相萃取法(SPE)［10］、树脂色谱法(离子交换树脂，大孔吸附树脂)和分子印迹固相萃取法 (MISPE)等［20，21，24］。分子印迹固相萃取法具有亲和性高和专一性强的特点，比较适用于富集复杂基质中的目标物。

2.2 检测方法

2.2.1 薄层色谱扫描法(TLC) TLC 法是辛弗林定性及定量分析中常用的重要方法之一，在《中国药典》2005 版中被采用为鉴别辛弗林的标准方法，然而近来研究发现TLC 法不能鉴别青皮辛弗林和枳实辛弗林［25］。高效薄层扫描法(HPTLC)是在TLC 基础之上的改良方法，其灵敏度和分离度都有很大的提高，可以准确地检出极微量的物质。Shawky，E［26］利用HPTLC 法实现了酸橙皮中辛弗林及其代谢物章鱼胺的同时测定，Rf值分别为0.292±0.008 3 和0.413 ±0.008 9，此方法特别适合分析植物提取物等复杂基质，可以自动同时分析多份样品，而不需要过多的清洗操作，只需要简单的样品前处理和少量的溶剂。

2.2.2 毛细管电泳法(CE) CE 法具有快速、高效、可重复性好、溶剂消耗量少、测定所需样品量小、移动方便等特点［27，28］。CE 法抗污染能力强，适用于天然产物等复杂基质的分析，然而CE 法同时测定的样品数量有限。

2.2.3 HPLC 法 HPLC 法是现在最常用的方法［29］，采用极性固定相和相对非极性的流动相将辛弗林分离(附表)。辛弗林分析方面多采用反相色谱柱，通过添加离子对试剂来提高峰对称性和分辨率，降低基质干扰，但是离子对试剂存在离子抑制效应、稳定性差等缺点。紫外检测器是目前HPLC 法中最常见的检测器，而荧光检测器的灵敏度更高［36］。总之，HPLC 法具有分离度高，操作简便、快速、重复性好、准确度高等优点，但是样品前处理较为复杂，固定相更换频率高，溶剂消耗量大，检测成本高。

附表 HPLC 法对不同样品中辛弗林的检测条件及线性范围

2.2.4 气相色谱法(GC) GC 法是天然产物分析与中药质量控制方面常用的分析方法。Andrade AS 等［38］使用该方法进行了酸橙中p-辛弗林的分析，线性范围为125～500 mg%，日内及日间精密度为3.6%和3.59%，平均回收率为78.1% ±3.64%。在缺乏液相和色谱联用设备条件时，GC 法可以作为辛弗林分析的替代方法。

2.2.5 联用技术 联用技术在辛弗林检测方面的应用有气相色谱-质谱法(GC-MS)、液相色谱—串联质谱法(LC-MS/MS)和气相色谱-离子阱串联质谱法(GC/ITMS)等。Marchei E 等［39］使用GC-MS 法对减肥类食品添加剂中辛弗林的含量进行了测定，线性范围为0.1～50μg/mg (固态)和0.1～50μg/mL (液态)，平均回收率在89.3%和90.5%之间，定量限为0.1μg/mg (固态)和0.1μg/mL (液态)，不同基质中的辛弗林含量在3.1μg/mg (固态)～480.2μg/mL (液态)之间。由于辛弗林具有高极性和低挥发性，所以在使用GC-MS 法分析时要消耗额外的时间来提高挥发性和热稳定性。液相色谱与质谱联用技术极大地提高了灵敏度。Beyer J 等［40］使用LC-MS/MS 方法分析了人体血浆中辛弗林等的含量，定量限达10ng/mL。Santana J 等［41］使用LC/UV 和LC/MS/MS 方法分析了酸橙类食品补充剂中的m-辛弗林和p-辛弗林的含量，其中LC/MS/MS 法对辛弗林的定量限达0.02ng (on-column)。Nelson BC 等［42］使用LC/MS/MS 方法分析了酸橙中辛弗林等物质的含量，其定量限达1pg (on-column)。Rossato LG 等［43］使用GC/IT-MS 对Caco-2 (人克隆结肠腺癌细胞)中的辛弗林进行了测定，得到了比LC-MS/MS 更好的回收率:p-辛弗林(79.1%～95.1%)，m-辛弗林(81.1%～96.8%)，而且分析时间不超过9min。

3 结论

辛弗林的各种检测方法中，TLC 法操作相对复杂，不适合快速分析，且灵敏度和分离度都相对较低。CE法具有快速、溶剂和样品量消耗少而且移动方便等特点，但是同时测定的样品数量有限。HPLC 法分离度高，操作简便、快速，同时测定的样品数量高，但是样品前处理较为复杂，溶剂消耗量大，色谱柱更换频率高。色谱联用技术具有快速、高灵敏度和分离度、能同时测定多份样品等特点，能够满足检测技术在未来多目标、快速、绿色环保等方面发展趋势的需求。未来联用技术的发展及其在饲料、饮料、食品添加剂等不同产品中辛弗林含量分析方面的应用;m-辛弗林和p-辛弗林的同时检测;辛弗林及其他生物胺的同时检测;不同品种、产地及生长期的柑橘产品中辛弗林的含量分析;辛弗林异构体和对映体在不同基质中的代谢、积累、药理药效以及对人体的副作用，特别是长期临床试验等方面都需要进一步的研究。

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