急性热应激对小鼠肺组织中热应激蛋白和细胞因子基因表达的影响

于　静，薛　佳，胡艳欣，汪　明（中国农业大学动物医学院，北京海淀100193）

急性热应激对小鼠肺组织中热应激蛋白和细胞因子基因表达的影响

于静，薛佳，胡艳欣，汪明
（中国农业大学动物医学院，北京海淀100193）

摘要：为研究小鼠在急性热应激条件下肺组织中几种热应激蛋白（heat shock proteins，HSPs）及一些细胞因子基因表达水平的变化情况，通过实时荧光定量PCR的方法检测小鼠急性热应激前后肺组织中HSP27、HSP60、HSP70、HSP90、HSP110及白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-17（IL-17）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、β干扰素（IFN-β）及γ干扰素（IFN-γ）的mRNA水平变化情况。结果显示，所有检测的热应激蛋白和细胞因子在热应激后0 h至2 h过程中均极显著升高（P<0.01），到4 h时恢复到正常水平。此试验结果为揭示急性热应激提高机体的抗病能力提供有价值的资料。

关键词：热应激；热应激蛋白；细胞因子；荧光定量PCR

中图分类号：S816.4

文献标志码：A

文章编号：0529- 6005（2015）10- 0020- 04

Corresponding author：WANG Ming

热应激，是指当环境温度超过动物和人体舒适温度（产热最低点与蒸发散热急剧增加起始点之间温度）时，动物和人为保护其正常的代谢作用，其各种生理机制所必须做出的各种反应的总和。有研究表明，短暂急性应激（27.5℃，1 h）能够增强西伯利亚鲟的非特异性免疫[1]；急性热应激（34℃，24 h）能够提升肉鹌鹑的抗氧化性能[2]；运动之前的急性热应激（41℃，20 min）能够保护机体免受肌肉损伤[3]；印度的医学文献中记载，热敷即热应激用于机体从寒冷、肠绞痛、僵硬、迟缓中恢复正常功能的治疗。本课题组前期试验证明，急性热应激（4 h，39℃±1℃）可以显著提高小鼠抵抗流感病毒的能力。因此，急性热应激提高机体抗病能力的机制成为需要进一步阐明的问题。

热应激蛋白（heat shock proteins，HSPs）分为HSP110、HSP90、HSP70、HSP60及小分子HSP和泛素等6个家族[4]。HSPs是一组在生物体中高度保守并具有重要生理功能的蛋白质分子家族[5]。大量的研究已经充分证明，HSPs具有分子伴侣作用及广泛的免疫学生物活性[6-7]。科学家们已经开始普遍关注HSP与机体肿瘤发生和控制、自身免疫耐受形成及自身免疫疾病发生等重大免疫学问题的关系。此外，人们也积极地将HSP用于抗细菌、病毒、寄生虫和肿瘤新型疫苗的研制当中，并取得了一系列可喜的成果。

细胞因子（cytokine，CK）即主要由免疫细胞分泌的、能调节细胞功能的小分子肽。主要参与调节免疫应答及炎症反应，刺激造血功能，参与组织修复等。当细胞因子与相应受体结合后，能通过靶细胞膜上的相应受体将信息传递到细胞核内，激活或抑制某些转录因子，从而诱导新蛋白的合成。这些新合成的蛋白发挥其生物学功能，形成免疫网络以保证机体的正常免疫应答及维持机体的平衡。

本试验通过研究急性热应激后小鼠肺组织内各种热应激蛋白和一些细胞因子基因表达的变化，为揭示急性热应激提高机体抗病毒能力的机制提供有价值的资料。

1　材料与方法

1.1实验动物小鼠：体重20 g左右6～8周龄雌性BALB/C小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2小鼠的急性热应激与采样将小鼠放于鼠笼中，鼠笼置于39℃±1℃温箱中热应激4 h，取出，在0 h，0.5 h，1 h，2 h，4 h 5个时间点颈椎脱臼处死，取米粒大小肺组织放入冻存管中，置于液氮中保存待用。

1.3荧光定量PCR法测定基因表达情况

1.3.1引物的设计根据GenBank上发表的序列，应用Primer Premier5.0设计荧光定量PCR引物（见表1），引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1　荧光定量PCR法所用引物

1.3.2反应条件95℃10 min；95℃15 s，50℃30 s，72℃45 s（读板）共40个循环。

1.4数据的分析处理本试验采用2-ΔΔCt法对细胞因子基因进行相对定量分析，选β-actin为内参基因[8-9]。用SPSS 10.0统计软件进行差异显著性分析，P<0.05为差异显著；P<0.01为差异极显著。用GraphPad Prism 5.0医学绘图软件对测得的数据进行统计作图。

2　结果与分析

2.1急性热应激对小鼠肺组织HSPs基因表达的影响如图1所示，39℃±1℃热应激4 h后，小鼠肺组织中各种热应激蛋白（HSP27，HSP60， HSP70，HSP90，HSP110）的表达量在零点时即呈现高表达，持续到2 h其表达量均极显著高于对照组小鼠（P<0.01），到4 h时降低到正常水平。

2.2急性热应激对小鼠肺组织细胞因子表达的影响如图2所示，39℃±1℃热应激4 h后，小鼠肺组织中IL-6, IL-17, TNF-α，IFN-β及IFN-γ的表达量均有所上升。其中，IL-6，IFN-β及IFN-γ的表达量在零点时即呈现高表达，在0.5 h表达量有所下降，而1 h后表达量大幅上升，持续到2 h其表达量均极显著高于对照组小鼠（P<0.01），到4 h降低到正常水平；IL-17和TNF-α的表达情况虽然较对照组而言上升显著（P<0.05），但较其他细胞因子而言不够稳定，上升幅度较小。

3　讨论

HSPs在炎症中有保护作用，当病原体侵入宿主后，可引起巨噬细胞吞噬，高浓度活性氧族（ROS）产生，淋巴细胞释放细胞因子IL-1、IL-2、IL-8及TNF等，ROS及细胞因子上调HSPs，激活HSPs基因，增强HSPs的表达；反过来，HSPs通过抑制ROS及细胞因子起到保护细胞和组织免疫炎症损伤的作用[10]。本试验结果显示，在急性热应激后，小鼠肺组织中多种HSPs的基因表达均有显著上升，能够加强机体对炎症的保护作用。

IL-6能诱导B细胞分化并产生免疫球蛋白、激活NK细胞、加速肝细胞急性期蛋白的合成、能被IL-1β和TNF-α诱导表达，同时又能在炎症反应中起调节作用，抑制IL-1β和TNF-α的过度表达，兼有促炎及抗炎作用[11]。IL-17是一种主要由活化的T细胞产生的致炎细胞因子，可以促进T细胞的激活和刺激上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞产生多种细胞因子从而导致炎症的产生。TNF-α是经典的促炎因子，能促进局部和全身的炎性反应，有类似IFN的抗病毒作用，可促进CTL表达MHC-I类抗原并增强CTL对病毒感染细胞的杀伤作用[12-13]。IFN-β具有广谱抗病毒作用及免疫调节作用，能促进大多数MHC I类抗原的表达，活化NK细胞和CTL，能抑制和杀伤肿瘤细胞[14]。IFN-γ是最重要的Th2型细胞因子，又称II型干扰素，主要由T细胞和NK细胞产生，可以诱导单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞及成纤维细胞等MHC II类抗原的表达，使其参与抗原提呈和特异性免疫的识别过程，能够促进巨噬细胞FcγR的表达并促进巨噬细胞杀伤病原微生物，并协同IL-2共同诱导淋巴细胞活化杀伤细胞（Lympho⁃kine active killer cells，LAK）的杀伤活性，促进T细胞表达IL-2R[15]。这些细胞因子的高表达有利于病毒感染时机体对病毒粒子的清除，能够起到保护机体抵抗病毒感染的作用。

图1　急性热应激对小鼠肺组织中热应激蛋白表达的影响

综上所述，本试验通过检测急性热应激后小鼠肺组织内多种HSPs和细胞因子的表达情况，揭示了急性热应激提高机体对病毒抵抗力可能与刺激多种热应激蛋白及相关抗病毒细胞因子的上调表达有关，为进一步研究急性热应激保护机体的机制奠定了基础。

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图2　急性热应激对小鼠肺组织中细胞因子表达的影响

Theeffects of acuteheat stress on geneexpression of several HSPs and cytokines in lung tissueof mice

YU Jing，XUE Jia，HU Yan-xin，WANG Ming
（College of Veterinary Medicine，China Agriculture University，Beijing 100193，China）

Abstract：The purpose of this study is to analyze the changes of several heat shock proteins（HSPs）and cytokines under the condition of acute heat stress in a mouse model.The changes of heat shock proteins（HSP27，HSP60，HSP70，HSP90 and HSP110）and cytokines（IL-6，IL-17，TNF-α，IFN-β and IFN-γ）before and after heat stress in the lung were determined by the method of RT-PCR on mRNA level .The results showed that the expression of the HSPs and cytokines were up-regulated after acute heat stress.These results will provide valuable information for the study of the protective roles of acute heat stress.

Key words：heat stress；Heat Shock Proteins；cytokines；Real Time PCR

通讯作者：汪明，E-mail：vetdean@cau.edu.cn

作者简介：于静（1989-），女，硕士生，从事预防兽医学研究，E-mail：yujing19891029@126.com

收稿日期：2014-07-14