中华蜜蜂与意大利蜜蜂性成熟处女蜂王蛋白质组比较分析

吴小波，王子龙，李淑云，颜伟玉，曾志将

(江西农业大学蜜蜂研究所，江西南昌330045)



中华蜜蜂与意大利蜜蜂性成熟处女蜂王蛋白质组比较分析

吴小波，王子龙，李淑云，颜伟玉，曾志将*

(江西农业大学蜜蜂研究所，江西南昌330045)

摘要：为了比较分析中华蜜蜂和意大利蜜蜂两蜂种处女蜂王性成熟期蛋白表达差异。试验采用双向电泳法建立中华蜜蜂和意大利蜜蜂处女蜂王性成熟期蛋白质表达谱，通过质谱分析与数据库检索，鉴定部分差异蛋白。研究发现：在中华蜜蜂蜂王和意大利蜜蜂蜂王中分别检测到2 205、2 417个蛋白点，两者之间的差异表达蛋白点有168个。其中，在中华蜜蜂蜂王高度表达的蛋白点有90个；在意大利蜜蜂蜂王中高度表达的蛋白点有78个。对部分差异蛋白进行质谱分析，共鉴定了19个蛋白点，其中在中华蜜蜂性成熟处女蜂王中上调表达的蛋白有副肌球蛋白、肌钙蛋白T、ATP合成酶以及丙酮酸脱氢酶等；在意大利蜜蜂性成熟处女蜂王中上调表达的蛋白有NADH辅酶Q氧化还原酶、保幼激素酸甲基转移酶、肌钙蛋白以及气味结合蛋白19前体等。中华蜜蜂与意大利蜜蜂性成熟处女蜂王体内存在大量蛋白表达差异，这些差异表达的蛋白质可能与两蜂种蜜蜂行为生物学有关。

关键词：中华蜜蜂；意大利蜜蜂；蜂王；蛋白质组

蜜蜂是一种资源共享、分工明确和相互交流的高度结构化的社会昆虫，并以3种级型存在，即蜂王、工蜂和雄蜂。蜂王和雄蜂是蜂群的繁育主体，雄蜂的主要职能是与处女蜂王交尾，保证蜂王能产双倍体的受精卵。蜂王为蜂群的母体，承担着繁育工作即产卵。为了提高蜜蜂种群适应性及避免近亲交配等，蜜蜂进化出有效的竞争交配机制，即蜜蜂的婚飞。处女蜂王羽化出房，到达性成熟以及婚飞时，其体内会发生明显的生理变化[1-6]。中华蜜蜂和意大利蜜蜂是两个独立的蜂种，两蜂种在繁殖、种群消长中存在明显区别[7-8]。中华蜜蜂是我国的宝贵蜂种资源，但自1896年中国引进西方蜜蜂100多年以来，西方蜜蜂已使中华蜜蜂分布区域缩小，种群数量急剧下降[9]。后来研究发现，中华蜜蜂蜂王自然交配受到意大利蜜蜂的干扰[10]，并推测处女蜂王婚飞交尾时，中华蜜蜂性成熟蜂王不仅会吸引中华蜜蜂的雄蜂来交尾，而且同时吸引大量西方蜜蜂的雄蜂，这样西方蜜蜂雄蜂会严重干扰中蜂蜂王与中蜂雄蜂正常交配，从而使中蜂蜂王交尾成功率大幅度下降[11]，后来研究也发现，两种蜂王性成熟期体表释放的主要信息素含量存在差异[4]。蛋白质组学是研究基因组所表达的全部蛋白质，不同时期以及不同环境条件下表达的蛋白质与其特定发育时期和生境条件的遗传调控存在内在关系[12]。本研究拟通过双向电泳的方法，比较分析中华蜜蜂与意大利蜜蜂性成熟期蜂王蛋白质组成的特征及差异，以期为深入研究蜂王干扰交尾机理提供一定理论基础。

1材料与方法

1.1供试昆虫

试验蜂群为江西农业大学蜜蜂研究所饲养的中华蜜蜂(Apisceranacerana)和意大利蜜蜂(Apismelliferaligustica)。其蜂群各含有1只同批次且交尾成功的蜂王。蜂群进行自由采集。试验样品的双向电泳和质谱鉴定试验在武汉市洪山区言行生物产品经营部进行。

1.2样品采集

按照标准的人工育王方法分别在中华蜜蜂和意大利蜜蜂蜂群中进行人工育王[13]，待处女蜂王出房后，囚入王笼并放入无王区。处女蜂王出房12 d后，分别采集性成熟的中华蜜蜂和意大利蜜蜂处女蜂王。为了避免蜂王腹部消化道食物对试验的影响，用解剖剪从蜂王侧面解剖并剔除蜂王体内的消化道，每只蜂王为一个样品,将每组4个样品送至双向电泳与质谱鉴定检测实验室，放入-80 ℃冰箱保存。

1.3蛋白质提取与双向电泳

具体操作步骤参照参考文献[14]。即采集样品后，先进行蛋白提取与纯化，再进行蛋白质溶解与定量，最后进行等电聚焦仪( 德国ETTAN IPGPHOR3)聚焦和双向SDS-PAGE电泳(德国ETTAN DALTsix)。其中，第一向等电聚焦程序为：S1 stp 300V 0:20Hr；S2 stp 700V 0:30Hr；S3 stp 1 500V 1:30Hr；S4 grd 9 000V 3:00Hr；S5 stp 9 000V 4:00Hr。第二向电泳程序为：S1 2W/gel 45 min，S2 17W/gel 4 h。电泳结束后将胶体放入固定液中进行固定，最后进行G-250染色。

1.4图谱扫描与质谱鉴定

染色后的凝胶使用透射模式进行扫描(ArtixScan M2)，扫描结果导入计算机，分析中华蜜蜂蜂王和意大利蜜蜂蜂王蛋白质点信息。在此基础上，利用凝胶差异斑点分析软件(ArtixScan M2)比较分析中华蜜蜂与意大利蜜蜂差异表达蛋白(灰度比值大于2)，确认分别在中华蜜蜂蜂王和意大利蜜蜂蜂王显著高表达的蛋白点。另外，从中华蜜蜂蜂王和意大利蜜蜂蜂王凝胶中分别选择10个和9个蛋白点进行质谱鉴定。利用德国布鲁克(Bruker Dalton)Ultraflex III TOF/TOF质谱仪进行质谱分析。UV波长为355 nm，重复速率为200 HZ，加速电压为20 000 V，最优质量分辨率为1 500 Da。扫描质量范围为700～3 200 Da，收集信号。胰酶自切峰为内标校正质谱仪。所有实验样品的质谱图均以用默认模式获得。利用软件flexAnalysis(Bruker Dalton)过滤基线峰、识别信号峰。利用BioTools(Bruker Dalton)软件搜索NCBI数据库，寻找匹配的相关蛋白质，同时查询其功能，来明确鉴定的蛋白质为何种蛋白质。

2试验结果与分析

2.1中华蜜蜂与意大利蜜蜂性成熟处女蜂王蛋白质图谱分析

将染色后的凝胶进行扫描后导入计算机，结果如图1所示。对图谱进行分析发现，中华蜜蜂性成熟处女蜂王和意大利蜜蜂性成熟处女蜂王中分别有2 205、2 417个蛋白点，两者之间存在168个差异表达蛋白点。对这些差异蛋白点分析发现，在中华蜜蜂蜂王中高度表达的蛋白点有90个，其等电点介于4.27～6.62，分子量介于10.80～67.63 Kda(表1)；在意大利蜜蜂蜂王中高度表达的蛋白点有78个，其对应的等电点介于4.21～6.70，分子量在10.44～91.84 Kda(表2)。另外，在中华蜜蜂蜂王和意大利蜜蜂蜂王中高表达蛋白比值为1 000 000的蛋白点分别有51、59个。

左：中华蜜蜂蜂王 queens of Apis cerana cerana；右：意大利蜜蜂蜂王 queens of Apis mellifera ligustica；图中标记的点为已鉴定的蛋白点The spots of Fig are the protein spots subjected to functional identification图1　中华蜜蜂与意大利蜜蜂蜂王双向电泳蛋白质表达图谱Fig.1　Profile of the 2-DE analysis of queens between Apis mellifera ligustica and Apis cerana cerana

编号No比值Ratio等电点pI分子量MW编号No比值Ratio等电点pI分子量MW编号No比值Ratio等电点pI分子量MW编号No比值Ratio等电点pI分子量MW编号No比值Ratio等电点pI分子量MWG014.159814.9867629G192.67495.0939120G372.718285.4633638G5510000005.4823324G7310000005.6215337G0210000004.9866139G202.805385.0739090G3810000005.2832536G5610000005.9022435G7410000004.5415210G032.914846.1458804G213.989545.1739060G3910000005.3732639G573.286684.8021669G7510000004.5414893G043.512936.0658329G2210000005.0638465G4010000005.1832587G5810000005.5721311G7610000006.1014645G0510000005.2156583G232.046115.5738200G412.742226.1631122G5910000005.6521047G7710000004.5414576G0610000005.6253250G2410000005.5737763G426.980326.3630876G602.485264.3020502G7810000004.5414180G0710000005.5152200G2510000004.9137302G4310000006.2430389G6110000005.2720049G7910000005.2613680G0810000005.7551683G2610000006.0036903G4410000006.0629816G6210000004.7319882G8010000004.7613357G092.013355.5050791G2710000004.6536677G4510000006.3428250G6312.60046.6219690G813.657344.9613119G1010000005.7549543G282.003485.8436415G4634.46125.0527893G6426.0346.5618730G824.075574.9313057G114.618444.7647021G292.625635.2135607G4710000005.827194G652.550465.4318730G8312.81024.3512825G1210000004.5845980G302.428966.0735843G4810000005.6425888G662.516494.5318518G8410000004.3112521G1310000005.7043531G3110000005.7235788G492.257284.2725400G672.976465.8117991G8510000006.0012255G142.058645.7242779G3210000004.7135541G5010000006.1524965G686.451124.5217402G8610000005.1011030G152.821445.8142041G3310000005.3735541G512.373286.3324621G6910000004.5217067G8710000005.7511030G1610000004.8740906G346.306995.7935081G524.158655.6424349G704.051044.6316925G8810000006.2411004G174.633965.3939573G3510000005.9734668G532.716934.7824214G715.084624.9116303G8910000005.6710939G182.395454.8639361G362.537726.1634285G5410000005.1123715G7210000004.8815681G9010000005.7310796

表2　意大利蜜蜂性成熟处女蜂王上调表达蛋白质

2.2中华蜜蜂与意大利蜜蜂性成熟处女蜂王蛋白质质谱鉴定

通过对差异蛋白质进行图谱分析，选择19个差异表达蛋白点进行质谱鉴定，其中10个蛋白在中华蜜蜂性成熟处女蜂王中高表达，其鉴定结果主要为副肌球蛋白、肌钙蛋白T、ATP合成酶以及丙酮酸脱氢酶等。另外9个蛋白质在意大利蜜蜂性成熟处女蜂王中高表达，主要为NADH辅酶Q氧化还原酶、保幼激素酸甲基转移酶、肌钙蛋白以及气味结合蛋白19前体等(表3)。

3结论与讨论

本研究旨在分析中华蜜蜂与意大利蜜蜂性成熟处女蜂王表达蛋白，以期了解两蜂种蜂王蛋白质组的差异。结果表明，中华蜜蜂和意大利蜜蜂性成熟处女蜂王中分别检测到了2 205、2 417个蛋白点，但差异蛋白点只有168个，可能与蜂王性成熟期的蛋白点相对比较保守有关，也可能是因为中华蜜蜂和意大利蜜蜂在蜜蜂属中亲缘关系最近的缘故。另外，也可能是因为两者表达的差异蛋白点太少，导致两种雄蜂很难辨别蜂王是中华蜜蜂蜂王还是意大利蜜蜂蜂王。对其显著差异表达的蛋白进行图谱分析，结果显示中华蜜蜂和意大利蜜蜂分别有90、78个上调表达蛋白。周天娥等[15]研究发现，中华蜜蜂雄蜂卵期表达的蛋白点也高于意大利蜜蜂，可能是这2种蜜蜂在长期进化过程中形成了符合各自发育规律的蛋白表达模式。中华蜜蜂与意大利蜜蜂蜂王体内含有比值为1 000 000的蛋白点数的蛋白51、59个，而且中华蜜蜂工蜂触角和雄蜂触角间的差异表达蛋白点大部分在意大利蜜蜂中高表达[16]，这也可能是因为两蜂种之间在嗅觉功能、能量代谢、分子运输等方面还是存在较大差异。

对中华蜜蜂性成熟处女蜂王中高表达的几种蛋白进行质谱鉴定发现，ATP合成酶、副肌球蛋白、肌动蛋白、丙酮酸脱氢酶以及蛋白酶体a亚基等在中华蜜蜂蜂王中高表达。副肌球蛋白是粗肌丝中含量最高的蛋白之一，它能帮助粗肌丝进行组装，并调节粗肌丝长度、直径以及肌肉收缩。副肌球蛋白编码基因的缺失，肌肉没有收缩性。肌动蛋白是微丝的结构蛋白，也具有收缩功能[17]。ATP合成酶和丙酮酸脱氢酶均为调节、催化合成ATP的关键酶[18-19]。这两种蛋白和酶在中华蜜蜂性成熟处女蜂王中高表达，可能与中华蜜蜂的特性有关，中华蜜蜂处女蜂王在巢房中活动速度相对较快，其体内的肌肉收缩、新陈代谢更加旺盛，从而需要这些蛋白和酶参与相应的物理和化学反应。

表3　已鉴定的19个蛋白点基本信息

蛋白酶体是一类具有水解蛋白功能的大分子复合物，在蛋白质降解过程中起着重要作用。蛋白酶体含有几种不同的a亚基和ß亚基，其中a亚基为结构性蛋白，而ß亚基为功能性催化蛋白，两者相辅相成，蛋白酶体ß亚基基因表达随机体新陈代谢、蛋白质代谢活动有关[20]。研究发现，蛋白酶体a亚基在中华蜜蜂蜂王体内高表达，这可能与蜂王婚飞有关，中华蜜蜂处女蜂王在进行婚飞时，其飞行速度比意大利蜜蜂快，持续时间可能比意大利蜜蜂长，在婚飞过程中需要产生大量的ß亚基，因此，蜂王在婚飞前表达大量的a亚基，为婚飞时集合蛋白酶体ß亚基奠定基础。

研究还发现，NADH-辅酶Q氧化还原酶，肌钙蛋白，保幼激素酸甲基转移酶以及气味结合蛋白等在意大利蜜蜂性成熟处女蜂王中高表达。NADH辅酶Q氧化还原酶是动物和植物体内呼吸链上参与传递电子的第一个功能酶，这些酶的表达会受外界环境、营养、杀螨剂等因素的影响，如昆虫采集了具有抗性的食物后，其体内的NADH辅酶Q氧化还原酶基因表达呈现明显的上升趋势[21]。意大利蜜蜂相对于中华蜜蜂，更容易感染螨虫，而在日常饲养过程中，常常用螨扑等杀螨剂对意大利蜜蜂进行杀螨处理，从而也导致蜂群体内的NADH辅酶Q氧化还原酶基因表达上调。

保幼激素酸甲基转移酶是保幼激素合成过程中最重要的调控酶，它通过将自身的甲基转移到由法尼酸环氧化产生的保幼激素酸后形成保幼激素[22]。保幼激素是导致蜂王发育的主要内源性信号，较高水平的保幼激素能阻止蜂王卵巢发生程序性细胞死亡，使卵巢得到充分发育，也能增加蜜蜂个体体重[23]。本研究发现，保幼激素酸甲基转移酶在意大利蜜蜂蜂王中高表达，主要原因在于意大利蜜蜂处女蜂王个体、卵巢等比中华蜜蜂蜂王大，需要更多的保幼激素酸甲基转移酶参与保幼激素的合成。

肌钙蛋白是一类肌肉调节蛋白，与原肌球蛋白结合，直接参与钙所控制的肌肉收缩，肌钙蛋白T是抑制或激活肌凝蛋白活性所必须的[24]。本研究发现，肌钙蛋白T在意大利蜜蜂处女蜂王中高表达，可能与生殖系统发育有关。意大利蜜蜂蜂王产卵能力比中华蜜蜂更旺盛，而且意大利蜜蜂卵巢也比中华蜜蜂大，卵巢形成卵子以及与精子相结合时，需要肌钙蛋白参与肌肉收缩，卵子和精子移动与结合等。

蜜蜂气味结合蛋白19的功能目前尚无报道，而且近期开展的蜜蜂相关转录组也未发现该蛋白基因在不同时期存在表达差异，可能是该蛋白功能相对比较保守。然而，本研究发现，该蛋白在意大利蜜蜂性成熟处女蜂王中高表达，这可能与蜂种有关，也可能与蜂王婚飞有关，意大利蜜蜂蜂王能够利用气味结合蛋白19行使辨别雄蜂集聚区，也可能具有其它特殊功能，具体功能有待于进一步研究与论证。

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Proteomic Comparison of Sexual Matured Queen between

ApisceranaceranaandApismelliferaligustica

WU Xiao-bo,WANG Zi-long,LI Shu-yun,YAN Wei-yu,ZENG Zhi-jiang*

(Honeybee Research Institute,Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045,China)

Abstract:This study aims to investigate the differentially expressed proteins of sexual matured queens betweenApisceranaceranaandApismelliferaligusticaby comparison of proteome profiles.Two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) was used to establish the proteomic maps of the two species of sexual matured queens.Part of differentially expressed proteins were identified by mass spectrometry and database search.The results showed that 2 205 and 2 417 proteins spots were detected respectively in the sexual matured queens ofApisceranaceranaandApismelliferaligustica,and 168 differentially expressed protein spots were found.90 proteins were significantly up-expressed in the sexual matured queens ofApisceranaceranawhile 78 proteins were significantly up-expressed in the sexual matured queens ofApismelliferaligustica.19 differentially expressed proteins were identified by mass spectrometry.The Paramyosin,Actin,ATP synthase and Pyruvate dehydrogenase were up-expressed in the queensApisceranacerana, while the NADH-ubiquinone oxidoreductase,Juvenile

hormone acid methyltransferase,Troponin T and Odorant binding protein 19 precursor were up-expressed in the queensApismelliferaligustica.A large number of proteins in queens betweenApisceranaceranaandApismelliferaligusticashowed expression changes,which might be related to the difference in behaviour biology of the two kinds of queens.

Key words:Apisceranacerana;Apismelliferaligustica;queen;proteome

作者简介:吴小波(1983—),男,博士,主要从事养蜂学教学与研究工作,E-mail:wuxiaobo21@163.com;*通信作者:曾志将，教授，E-mail:bees1965@sina.com。

基金项目:国家蜂产业技术体系资助项目(No.CARS-45-kxj12)、国家自然科学基金项目(31060327)、江西省科技支撑计划项目(20141BBF60033)和 江西省教育厅科技计划项目(GJJ13280)

收稿日期：2015-03-06修回日期：2015-05-06

中图分类号：S893.2；S893.3

文献标志码：A

文章编号：1000-2286(2015)06-1057-06

吴小波，王子龙，李淑云，等.中华蜜蜂与意大利蜜蜂性成熟处女蜂王蛋白质组比较分析[J].江西农业大学学报，2015，37(6)：1057-1062.