熊去氧胆酸联合异甘草酸镁干预四氯化碳诱导小鼠急性肝损伤研究

王淑萍，黄全祥，张宏岐

(湖北省宜昌市第三人民医院1.肝病科，2.药剂科，湖北 宜昌 443000;3.三峡大学医学院 药学系，湖北 宜昌 443000)

急性肝损伤是各种肝脏疾病的发生、发展及最终走向肝功能衰竭的始动环节和共同途径［1］。急性肝损伤为慢性肝病基础，可引起急性肝功能受损及病理组织学异常，一直是全球关注的热点研究方向［2］。临床研究表明，熊去氧胆酸(UDCA)对于慢性肝病具有良好的治疗效果，其主要通过无毒性的UDCA 替换或清除毒性胆汁酸，阻止胆管上皮细胞凋亡而发挥作用，在临床上得以广泛应用［3－4］。异甘草酸镁(MgIG)是甘草酸单一立体异构体镁盐，在临床治疗多种肝损害均具有较显著的疗效，不良反应少，与其他护肝类药物联用，疗效可有明显提高［5－6］。目前有关二者联用的相关报道较少，本研究通过探讨UDCA 联合MgIG 干预小鼠急性肝损伤的疗效，为有效治疗慢性肝脏疾病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级雄性小鼠50 只，18～22 g，购于三峡大学实验动物中心，合格证号:SYXK(鄂)2011－0061，采用12 h 昼夜交替照明，环境温度:(22±4)℃，湿度:40%～50%。

1.2 主要试剂与仪器

主要试剂:UDCA 胶囊购自德国福克药厂;MgIG 购自江苏正大天晴药业股份有限公司;丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒、总蛋白含量测定试剂盒、丙二醛(MDA)含量测定试剂盒、总抗氧化能力(TAOC)测定试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶活性(GSH-PX)测定试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所。

主要仪器:Stat Fax-2100 型酶标仪(单通道)，美国Awareness 公司;U-3010 紫外-可见分光光度计，日本Hitachi High-Technol 公司。

1.3 实验方法

随机将50 只小鼠分为空白组、模型组、UDCA组、MgIG组、联合组5组，每组10 只。给药组每日分别灌胃给予UDCA 25 mg/kg、MgIG 5 mg/kg、UDCA25 mg/kg+MgIG15 mg/kg，1 次/d，连续3 d，每只0.2 mL，空白组和模型组灌胃给予等体积生理盐水。末次给药1 h 后，空白组腹腔注射生理盐水0.1 mL/10 g，其余各组腹腔注射0.1%CCl4花生油溶液0.1 mL/10 g［7］，禁食不禁水，16 h 后摘眼球取血，离心取血清，置4 ℃保存备用;同时立即剖腹取肝脏，4 ℃预冷生理盐水冲洗，滤纸拭干、称重，计算肝脏指数(肝重/体重×100%)。其中每只小鼠称取肝脏小叶0.5 g，加预冷的9 倍体积的0.86%生理盐水于玻璃匀浆器中匀浆，2500 r/min 离心10 min，上清液置4 ℃保存备用。其余肝组织于4%多聚甲醛固定液中固定24 h，用水冲洗后经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，进行石蜡包埋处理后切成4 μm 厚的薄片。

1.4 观察指标

改良赖氏法测定血清ALT、AST，考马斯亮蓝法测定蛋白含量。血清ALT、AST，肝组织MDA含量、SOD、T-AOC、GSH-PX 的测定均严格按试剂说明书进行操作。采用苏木精-伊红染色、Masson三色染色观察肝组织变化。

1.5 统计学方法

实验数据应用SPSS 19.0 处理，定量资料采用均数±标准差()表示，组间均数比较采用单因素方差分析和t 检验分析组间差异，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝脏指数

结果见表1。各组肝脏指数比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。

表1 对小鼠肝脏指数的影响(，n=10)

表1 对小鼠肝脏指数的影响(，n=10)

2.2 血清生化指标

模型组血清ALT、AST 含量较空白组明显升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。与模型组比较，UDCA组，联合组血清中的ALT、AST 含量均有明显降低，差异具有统计学意义(P＜0.01)，其 中联合组优于单独用药组(P＜0.05 或P＜0.01)。见表2。

表2 对小鼠血清ALT、AST 的影响(，n=10)

表2 对小鼠血清ALT、AST 的影响(，n=10)

与空白组比较* P＜0.05;与模型组比较##P＜0.01;与UDCA组，△P＜0.05;与MgIG组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

2.3 肝组织匀浆指标

与空白组比较，模型组肝组织MDA 含量升高，SOD、T-AOC、GSH-PX 活性降低(P＜0.01);各给药组肝组织MDA 含量与模型组比较均有所降低，SOD、T-AOC、GSH-PX 活性有所增加(P＜0.01)，其中联合组MDA 降低较UDCA组明显(P＜0.05)。见表3。

2.4 组织病理学观察

苏木精-伊红染色结果显示:空白组小鼠肝脏结构正常，肝细胞排列整齐有序，未见明显病变部位，及坏死细胞、成纤维细胞存在;模型组在汇管区可见明显坏死病灶，肝组织结构发生明显变化，形成完整假小叶，肝细胞排列混乱，失去正常肝组织所具有的放射状排列;MgIG组、UDCA组和联合组肝脏病变程度均明显减轻，坏死肝细胞明显减少，脂肪化程度减轻，肝细胞排列紊乱情况有所改善。联合组效果最佳。见图1。

表3 对小鼠肝组织中MDA、SOD、T-AOC、GSH-PX 的影响(，n=10)

表3 对小鼠肝组织中MDA、SOD、T-AOC、GSH-PX 的影响(，n=10)

与空白组比较，＊＊P＜0.01;与模型组比较，##P＜0.01;与UDCA组，△P＜0.05。

图1 药物对小鼠肝组织病变程度的影响 HE 染色，100 倍

Masson 三色染色结果显示:空白组小鼠肝脏组织正常，无明显可见胶原沉积;模型组小鼠肝脏中存在大量胶原沉积，且相互连接成网状;用药组胶原沉积情况明显少于模型组，见图2。

图2 药物对小鼠肝组织病变程度的影响 Masson 三色染色，100 倍

对各组肝脏切片采用DMR 显微图像分析系统进行胶原沉积面积积分，结果用药各组小鼠肝组织中胶原组织含量均有一定降低，与模型组比较差异具有统计学意义(P＜0.05 或P＜0.01)，MgIG组、联合组效果优于UDCA组(P＜0.01)，见表4。

表4 药物对小鼠肝组织胶原面积的影响(，n=10)

表4 药物对小鼠肝组织胶原面积的影响(，n=10)

与空白组比较，* P＜0.05，＊＊P＜0.01;与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01;与UDCA组，△△P＜0.01。

3 讨论

肝损伤是由各种肝脏疾病所产生的病变结果，常见的包括病毒性肝损伤、药物性肝损伤、酒精性肝损伤和免疫性肝损伤［8］，其主要表现为脂肪肝、胆汁郁积、肝坏死、肝纤维化、肝硬化甚至肝癌等［9］。

UDCA 为胆汁淤积性肝病内科治疗的常用药物。研究显示，UDCA 对胆管结扎、CCl4、酒精诱导的肝损伤动物模型都有显著治疗作用［10－11］。其作用机制主要通过抑制肝脏氧自由基，减少TNFα 和TGF-β1等细胞因子的产生［12］，诱导肝纤维细胞凋亡发挥保肝作用［13］。MgIG 具有较强的抗炎、保护肝细胞膜及改善肝功能的作用，常用于多种原因所致的肝功能异常［14］，还具有类糖皮质激素的作用，可通过免疫调节等作用降低化疗后的不良反应，且能有效减少肝细胞变性、坏死及炎症细胞浸润，促进肝细胞再生［15］。

本研究显示，UDCA、MgIG 能有效提升因注射CCl4而降低的SOD 和GSH-PX 活性，加快肝组织中超氧阴离子的清除速度，保护肝细胞免受过氧化损伤;各给药组小鼠肝组织T-AOC 提升，说明药物不仅能促进自由基清除，还能阻断过氧化链，提升小鼠机体整体的对抗氧化应激的水平。UDCA 与MgIG 联合用药能显著降低模型组小鼠血清ALT、AST 水平和过氧化物终产物MDA 的含量，病理学检查提示联合用药组肝细胞变性、坏死及炎细胞浸润明显减轻，病变程度明显降低。表明UDCA、MgIG 具有协同作用，联合应用对CC14所致小鼠急性化学性肝损伤具有保护作用及抗纤维化作用，其机制可能与其清除自由基、提高抗氧化酶活性等有关。

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