原子力显微镜在生命科学领域研究中的应用进展

鞠安，蒋雯，许阳，杨升，常宁，王鹏，顾宁

(东南大学 生物科学与医学工程学院，江苏 南京 210009)

·综 述·

原子力显微镜在生命科学领域研究中的应用进展

鞠安，蒋雯，许阳，杨升，常宁，王鹏，顾宁

(东南大学 生物科学与医学工程学院，江苏 南京 210009)

在微纳尺度上对细胞及相关的生物学过程进行观察是近年来的热点。原子力显微镜(AFM)以其纳米级别的分辨率、超高的灵敏度以及对各种工作环境良好的兼容性而被广泛应用于生命科学领域。作者介绍AFM在细胞性质、细胞或生物大分子间相互作用以及观察动态生物过程等方面的研究进展，归纳传统AFM存在的主要问题以及近年来针对这些问题作出的改进。

原子力显微镜； 生命科学； 研究进展； 问题与改进； 文献综述

原子力显微镜(atomic force microscopy，AFM)，是扫描探针显微镜(scanning probe microscopy)的一种。它的核心结构是一个对力非常敏感的微悬臂，其尖端有一个微小的探针。当探针靠近样品表面时，探针尖端的原子与样品表面的原子之间产生极其微弱的作用力，从而使微悬臂弯曲。探测器将微悬臂的形变信号转换成光电信号进行放大，就可以得到原子之间力的微弱变化的信号，获得作用力分布信息，从而以纳米级分辨率获得表面形貌结构信息及表面粗糙度信息(如图1)。正是由于AFM具有微纳级别的空间分辨率以及皮牛顿级别的测力灵敏度[1]，它渐渐成为研究活细胞表面形貌、结构以及生物过程的强有力的工具，在生物学领域得到广泛应用。

1 AFM应用于生命科学领域的优势

自1675列文虎克发明光学显微镜以来，人们就开始利用显微镜这个平台来观察微观世界。后来，电子显微镜(EM)、扫描隧道显微镜(STM)、扫描探针显微镜(SPM)等相继问世。然而，光学显微镜由于可见光波长的限制，精度和分辨率远远达不到观察生物过程的要求；无论是透射EM还是扫描电子显微镜，都是利用打到样品表面的高速电子束来反映样品形貌特征，势必涉及对样品一定程度的损伤；STM是利用隧道效应，检测隧穿电流，因此一般也要求样品为导体或半导体。与这些显微镜对技术和样品的高要求相比，AFM有着以下几点明显的优势：(1) 样品制备简单，对样品的破坏较其他技术小得多，无须经历电子束的轰击或者免疫组化的荧光染色过程；(2) AFM比一般的STM更有优势的地方在于，它可以在液态环境下检测绝缘物质，尤其是在生理学环境下[2]；(3) 能提供生物分子的高分辨率的图像；(4) 观察生物大分子之间的相互作用，如受体-配体、生物素-亲和素、抗原抗体等；(5) 能利用针尖对单细胞、单分子进行操作，如在细胞膜上打孔、切割染色体等，也可以辅助研究一些细胞生物学领域的问题，比如信号、细胞分化、细胞黏附等[3]；能与其他显微镜等技术互补，从多个角度共同展现生物过程。

图1 AFM的成像原理

Fig 1 The Imaging principle of AFM

2 AFM在细胞生物学中的应用

基于AFM较其他显微技术的无可比拟的优势，前人已经利用这个平台在生物医学领域进行了卓有成效的研究工作，从多个角度深入探究了生命科学领域中值得关注的问题。

2.1 AFM对细胞膜表面形态的研究

细胞膜有重要的生理功能，它既使细胞维持稳定代谢的胞内环境，又能调节和选择物质进出细胞。AFM能够观察到细胞膜表面的超微结构，因此它可以用来观察正常细胞与病变细胞的细胞膜，发现两者的异同，为临床病理诊断提供新的视角和方法。

Braga等[4]在生理条件下观察了大肠杆菌受抗生素作用后外膜的形态变化，所获得的AFM图像清楚地显示出外膜上有由成百上千个脂多糖分子(LPS)组成的突起，他们认为就是这些LPS斑块有效地控制着大肠杆菌的外膜通透性。关维等[5]用2%的福尔马林溶液和枸橼酸盐缓冲液制备AFM样品，分别观察了人成纤维细胞(Fb cell)、人宫颈癌细胞(Hela cell)、人乳腺癌细胞(Mcf7 cell)、人成纤细胞癌变细胞(Ma-Fb)。当扫描范围为500 nm时可见到Fb细胞膜是由圆形、椭圆形等大小较一致的隆起组成，结构比较饱满、光滑，隆起的凹陷排列疏密程度适中。而癌变细胞膜隆起结构明显增大增高，细胞膜由圆形、三角形、多角形、不规则形等多种形状的隆起构成，彼此之间形成的缝隙也变得凸凹不平，排列疏密不均，相对紊乱。邢晓波等[6]用AFM研究不同刺激条件下T细胞的形态和生物力学特征，发现静息的T细胞呈较为规则的圆形，细胞表面相对光滑均一，而经过超抗原SEA和植物凝集素PHA活化的T细胞膜表面粗糙度增大，细胞表面形成100 nm～1 μm的颗粒状团簇结构。而且他们还发现不同的刺激剂对T细胞的活化程度不同，从而会导致不同的形态结构和膜纳米结构。

2.2 AFM测定细胞弹性以及力学性质

病变这一生理过程与细胞的形态和力学性质有关。细胞形态学的变化会影响和反映细胞性质、功能以及细胞微环境的改变。健康细胞与病理状态的细胞在机械性能上是完全不同的。抓住这一点，可以利用AFM测量出的细胞弹性性质识别癌细胞，以及辅助诊断红细胞相关的各种疾病等，从细胞层面上对各种疾病进行早期诊断和治疗。

杨氏模量可视为衡量材料产生弹性变形难易程度的指标，其值越大，使材料发生一定弹性变形的应力也越大。大量研究表明，肿瘤细胞与正常细胞的杨氏模量是不同的，这说明了杨氏模量可以作为一个新的肿瘤标记。已知弹性常数的AFM微悬臂探针用于力曲线检测已成为目前研究生物微观力学不可或缺的强有力的工具。AFM所获得的力-距离曲线的斜率就是样品的弹性模量[7]。Ding等[8]利用AFM获得了宫颈鳞癌细胞的杨氏模量等力学参数，分析了正常细胞和癌变细胞弹性性质的不同。与传统的细胞学分析方法相比，AFM检测分析的方法可以避免实验中主观因素相互干扰带来的假阳性或者假阴性。他们也利用高分辨率的成像技术如环境扫描电子显微镜(ESEM)拍摄了细胞表面的形态，验证了AFM图像的分析结果。Cross等[9]检测了体外培养24 h的肿瘤细胞的模量，发现它们比正常细胞要柔软70%。这些肿瘤细胞是从肺癌、乳腺癌和胰腺癌病人的胸膜积液中取得的。Lekka等[10]也发现人类膀胱上皮肿瘤细胞的硬度和可变形性比正常细胞有所下降。此外，他们也利用AFM对45个患有冠状动脉疾病、高血压和糖尿病的病人和13个健康人的红细胞模量进行了对比研究[11]。从每个血样中随机选取20个左右的红细胞，在每个细胞表面选择20～30个点进行测量，以获取细胞弹性模量的分布。糖尿病患者和吸烟者血液中红细胞模量平均值和宽度分布相比健康人都明显增大，而且模量平均值与病人年龄相关。利用这些统计数据，我们可以对病人进行年龄分布、病变程度等早期诊断和治疗，为疾病的预测提供便利。

2.3 AFM检测活细胞间相互作用

AFM也可以对细胞间的相互作用进行观察[12]。将一种细胞连接在AFM扫面探针的尖端，使针尖功能化，对另一种单层排列的细胞进行扫描就可以进行细胞间相互作用的研究(如图2)。如Thie等[13]利用AFM第一次界定了滋养细胞和子宫内皮细胞间的相互作用。他们在微悬臂上修饰上微珠，再将滋养细胞包被在微珠表面，去接近单层排列的子宫内皮细胞，用AFM获得两者之间作用力变化的情况。Omidvar等[14]将T47D细胞附着在包被了伴刀豆球蛋白A的微悬臂上，该微悬臂作为检测两个T47D细胞间黏附力的探针，来测量细胞间的局部刚度。首先带有T47D细胞的微悬臂靠近培养的细胞，让两个细胞相互接触。在一定的时间之后，微悬臂被拉回。两个细胞之间持续作用，直到两个细胞完全被分开。微悬臂的垂直偏转与针尖的细胞作用力成正比。AFM的这一作用，对研究多细胞生物体中细胞间的相互作用有重要启示，例如可研究动物胚胎移植中细胞的免疫排异反应，还可以研究在病灶处病变细胞与健康细胞间有着怎样的界限，如何相互影响相互作用并达到一种动态平衡等过程。

图2 AFM观察细胞间相互作用

Fig 2 Observing interactions between cells by AFM

2.4 AFM观察动态生物过程

AFM也是观察细胞生物过程非常有效的工具[15]。Haberle等[16]用AFM记录了单个病毒颗粒从被感染细胞中释放的过程。类似地，Ohnesorge等[17]研究了痘病毒和活细胞，得到了痘病毒感染活细胞全过程的AFM图。通过活着的细胞观察子代病毒颗粒，并用AFM在水溶液环境中在分子水平分辩出有规则重复的烙铁状结构和准有序的环状结构。观察中发现：在感染前后最初几小时，细胞并无显著变化；子代病毒粒子沿细胞骨架进入细胞内部，还有胞吐、病毒颗粒聚集等现象。通过AFM图像可以看出哑铃状小泡逐渐形成、消失并在细胞膜表面形成凹陷的全过程。Yamashita等[18]发现了趋磁细菌细胞表面的网状结构。他们发现，细胞外膜完全被一种网状结构所覆盖，在这种结构的边缘有很多孔蛋白颗粒。用AFM追踪网孔的运动轨迹，动力学图像揭示了在小孔边缘的颗粒是如何进出这些结构的。第一次用AFM观察到了活细胞表面的分子动力学，直接展示了孔蛋白类结构在磁性颗粒穿过细胞膜的过程。Yokokawa等[19]将兔子肌肉中的钙离子泵提纯出来，放在云母板上的脂质环境中，用fastXY模式(可以实现显微镜样品电动化XY轴定位的一种扫描模式)来检测钙离子泵运动的动力学过程。他们发现这一过程受到钙离子和ATP的共同影响，而且在一种钙离子泵抑制剂毒胡萝卜素的存在下，动力学过程被明显地抑制。

2.5 AFM观察生物大分子之间相互作用

除了活细胞层面的相互作用，生物大分子之间相互作用也能深刻反映出生命活动的本质。

蛋白质是生命活动的承担者，是生命的物质基础，调节着人体内各种生命现象的过程，作为遗传物质的基因也必须经过蛋白表达之后才能体现遗传形状。Yokokawa等[20]研究了细胞内与蛋白质折叠调节相关的分子伴侣的行为。GroEL是大肠杆菌中的一种分子伴侣，而GroES是它的辅分子伴侣。当GroES与GroEL结合后，AFM图像显示它能诱导近端GroEL的一个构型变化，增加中心孔洞的体积。当中心孔洞可以与不成熟蛋白接触时，在ATP下可以看到GroEL分子由闭环状态变成开启的状态。AFM所得的数据也可以清晰显示出开启形态的GroEL比闭合的有更高的结构。

在生物体内，DNA与蛋白质间的相互作用有着同样举足轻重的地位。在转录、翻译的过程中，DNA与特定的蛋白质如解旋酶、聚合酶、启动因子等的结合就决定着生命活动的开启。Gilmore等[21]利用AFM以每500ms拍摄1次的速度，清晰地观察到了蛋白质在DNA上的结合情况。因此，AFM可以真正帮助我们深入地“看到”生命活动的本质。

2.6 AFM测定细胞电学性质

细胞不论在静止状态还是活动状态，都会产生与生命状态密切相关的、有规律的电现象，生物电信号包括静息电位和动作电位，其本质是离子的跨膜流动。因此，研究细胞的电生理学也成为了生命科学领域一个重要的分支。

张文晓[22]在AFM系统中增加了导电模块，在迎春花细胞、酵母菌细胞等样品和探针之间加一个偏压，在扫描的过程中，同时获得样品的表面形貌和电流像，且在成像的同时检测探针和细胞样品之间的电流(如图3)，得到样品表面形貌和局域电流分布及两者之间的对应关系，从而实现AFM在纳米尺度上对细胞样品电学特性的分析检测。同个细胞的不同位置所体现的细胞导电性是有所差异的，细胞核、细胞器所在的位置与细胞质的导电性有所差别，细胞中间部分与细胞膜边缘的导电性也不尽相同。可以将整个细胞的导电性看作一个滑动变阻器，而AFM探针可以针对各个阻值进行测量。因此，基于AFM探针对同一个细胞的不同位置进行测量，为检测癌细胞等可能出现的多核现象提供了可能。

3 AFM应用遇到的主要问题

随着纳米技术的不断深入发展，研究人员对AFM仪器的功能要求越来越高。AFM在生命科学领域的表征、测量以及操作方面的不足主要体现在以下几个方面。首先是定位精度不高。由于机械加工技术的限制，作为驱动器的压电陶瓷存在着迟滞、蠕变等非线性因素导致定位准确性不够好。当成像速度、扫描范围加大的时候，非特异性识别的现象就更加明显[23]。其次是成像速度较慢。由于驻点扫描的成像原理，AFM的成像速度不及传统的显微镜。另一方面，AFM内嵌的控制与成像算法尚未达到超高速扫描的要求。此外，由于微悬臂在几何结构上的二态构造导致的不对称，当长时间持续扫描样品的时候会产生针尖的漂移[24]。AFM工作时，一般要求生物样品被放置在平的云母基底上且需要被固定住。但在研究动力学过程时，固定化就会在一定程度上阻止正常的生物活动，导致这些过程的三维结构很难被拍摄到。因此在动力学AFM的研究中，固定分子的技术有着很大的讲究，必须保证分子依然可以在空间上自由，保持接近生理学状态[21]。此外，针尖的尺寸也是影响图像质量的重要因素。越粗糙的样品，受针尖尺寸的影响越明显。针尖尺寸越小，表面形貌越不失真，但是尺寸越小，技术难度越大。

图3 AFM导电模块示意图

Fig 3 Schematic diagram of the Conductive Module

4 针对传统AFM的技术改进

基于传统的AFM存在的一些技术上的瓶颈，近年来国内外众多团队致力于在硬件和软件上进行改善，取得了一定的成果和进展。

4.1 AFM与其他显微技术和设备结合

Chaudhuri等[25]用侧视荧光显微镜和AFM结合，观察负载轴上细胞变形和细胞骨架的重排。实验可观察到细胞形状的变化、力诱导的破裂导致的细胞形状的相关变化以及在细胞间粘连的过程中细胞膜丝形成的过程。测量细胞收缩力的时候，还可以观察细胞骨架的重排以及应力纤维的形成。SR超分辨率荧光显微镜已经超越了传统的荧光显微镜，它的横向分辨率已经可以达到纳米级别。比如双色受激发射损耗(STED)显微镜。把STED与AFM结合，STED共聚焦图像相当于用作AFM移动的地图，让AFM找到目标分子或者细胞[26]。目前，也有“随机光学重建显微镜”(STORM)与AFM配合的，可以拍摄出单分子水平的图像。Suzuki等[27]对AFM的工作模式进行了改造，使得固定在微悬臂上的探针在XY方向扫描 ，而不是样品台在XY方向扫描。这就意味着“解放”了样品，使其可以被放到透明的基底上，用荧光或者可见光去研究，用倒置的光学显微镜去看。

4.2 高速AFM

近年来应用较为广泛的是响应速度更快的压电驱动器。它可以提升AFM的扫描速度，使得AFM成像的时间间隔更小，在一定程度上趋近实时图像；或通过重新设计扫描器结构，从机械结构上降低水平方向振动对竖直方向的耦合影响，进而提高了高速扫描时的成像精度。日本金泽大学的科研团队则使用3块压电陶瓷分别控制样品台3个方向上的运动，取代了运动耦合误差较大的管式扫描器，实现了对活性蛋白的连续成像[28]。

4.3 探针针尖的修饰与改造

Shibata等[29]用无定型碳做了一个极长(3 μm)极薄(直径5～8 nm)的针尖，让它在力常数为200 pN·nm-1的软微悬臂上垂直生长。这种新型的设计可以使得微悬臂在轻敲模式(自由振幅约为100 nm，频率为800 kHz)下扫描的时候，与细胞之间的碰撞达到最小，同时成像时保持较高的空间分辨率。用该设备观察mEGFP转染的COS-7细胞表面形态动力学，发现它对细胞的成像可以保持1 h以上，不对细胞产生任何明显的损伤。同时发现细胞的前缘有膜的褶皱、延伸以及丝状伪足的回缩。这种长期的成像稳定性可以把细胞对于外界刺激的形态学动力学反应可视化，比如在靶向给药或者受体配体相结合的过程中，就需要长期稳定的监测。将该设备与高级光学显微镜结合，还可以进一步证实蛋白质功能以及细胞活动，甚至了解更多分子作用以及细胞内信号转导的信息。

4.4 算法改进

除了在硬件上对AFM设备进行改进，研究人员同样致力于改善内嵌的控制算法。针对微悬臂在持续长时间扫描的过程中产生的漂移问题，Spagnoli等[24]开发了一种叫作Stick-and-Move(SaM) Routine的新算法，使微悬臂首先扫描细胞表面的兴趣位置，直到达到了一定的力的限度(一般是100 pF)然后被拉回基底，再测一个力与距离的曲线。信号代表了两个峰，一个是接触基底，一个是接触细胞。用Python语言进行数据分析之后，可以在细胞位置的峰上减去基底的峰，同样得到持续扫描样品的等价信号，从而进行力-距离曲线的分析。除了针对单细胞分析过程中的算法改进，张文晓[22]解决了原子力探针在对同种类大量活体细胞进行反复测量的过程中，耗时过长会减少细胞存活率或是细胞分裂引起的目标混乱的问题。主要是采用“蚁群算法”对探针进行路径的最优规划，使探针行走的路径最短，用时最少。

5 总结与展望

AFM能在固体表面达到微纳级别的分辨率，也可以在接近生理状态的液体环境内工作，因此可以被用于生物样本比如蛋白质、核酸、膜磷脂甚至是在生理过程中的活细胞的检测。AFM作为一种高分辨率的形貌表征工具，可以很好地辅助生命科学研究中的定性、可视化分析，使得生命过程更加清晰直观。尽管仍存在不完善之处，但未来若从改善针尖尺寸、开发双探针甚至多探针系统[30]、提高扫描速度以及选用机械性能更加优良的探针材料等方面作出努力，相信AFM能更好地为我们所用，帮助我们更透彻地理解纷繁复杂的生命系统。

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2014-04-13

2015-04-29

国家重大科学计划(973计划)项目(2011CB933500)；国家自然科学基金资助项目(61127002)

鞠安(1994-)，女，江苏南通人，在读本科生。E-mail:chris.ju@qq.com

顾宁 E-mail:guning@seu.edu.cn

鞠安，蒋雯，许阳，等.原子力显微镜在生命科学领域研究中的应用进展[J].东南大学学报：医学版，2015，34(5)：807-812．

Q-336

A

1671-6264(2015)05-0807-06

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.05.028