miR-19b沉默对P19细胞分化及线粒体功能的影响

刘雪华，朱莎莎，余章斌，朱春，李萌萌，韩树萍，胡晓山，朱金改，彭宇竹

(1.南京医科大学，江苏 南京 210029； 2.南京医科大学附属南京妇幼保健院 儿科，江苏 南京 210004)

·论 著·

miR-19b沉默对P19细胞分化及线粒体功能的影响

刘雪华1，2，朱莎莎2，余章斌2，朱春2，李萌萌2，韩树萍2，胡晓山2，朱金改2，彭宇竹1，2

(1.南京医科大学，江苏 南京 210029； 2.南京医科大学附属南京妇幼保健院 儿科，江苏 南京 210004)

目的：通过沉默微小RNA-19b(miR-19b)研究miR-19b对P19细胞分化及线粒体功能的影响。方法：转染miR-19b沉默质粒与空载质粒进入P19细胞建立起稳定的细胞系；线粒体功能分析用以检测细胞凋亡；诱导分化P19细胞，实时定量荧光PCR检测miR-19b沉默后细胞分化关键基因表达水平。结果：TargetScan 5.1软件及双荧光素酶报告基因系统共同证实，Wnt1为miR-19b在P19细胞中发挥作用的靶点(P<0.05)；测定第0、4、6、8、10、12天cTnT、NKX2.5、GATA4等基因的核酸表达量显示，心肌分化相关标志基因逐渐增高，miR-19b沉默组明显低于对照组(P<0.05)；于分化第10天检测线粒体功能，发现miR-19b沉默组线粒体DNA拷贝数的相对含量高于对照组，其活性氧水平显著低于对照组，ATP水平也高于对照组(均P<0.05)。结论：miR-19b沉默可抑制细胞凋亡，抑制心肌细胞分化。

微小RNA-19b沉默； P19细胞； 线粒体； 分化

微小RNA(microRNA,miRNA或miR)是一类小分子非编码单链RNA，长约22个核苷酸，广泛存在于植物、线虫以及人类的细胞中。miRNAs是进化保守的非编码小RNAs，它可以作为“精密调节器”和(或)“保卫者”在转录后水平发挥作用，保持生物内环境的稳态。而本研究关注的miR-19b属于miR-17-92系列，miR-17-92簇编码6个成熟miRNAs，分别是miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1。有研究发现，miR-17-92簇完全缺失可导致胚胎发育受阻及围产期死亡，可能会出现心室壁变薄、室间隔缺损和肺发育不全等[1]。另外，miR-17-92簇还可以影响心肌前体细胞向心肌细胞分化[2]。P19细胞又叫畸胎瘤干细胞，在1%二甲基亚砜诱导下可分化为心肌样细胞。于是我们通过沉默miR-19b后诱导miR-P19细胞分化，模拟心脏发育过程，研究其在心脏发育过程中可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

P19细胞购自美国菌种保藏中心(ATCC)，α-MEM培养基购自美国HyClone公司，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自美国Gibco公司，Trizol、转染试剂Lipo2000购自美国Invitrogen公司，胰蛋白酶、DCFDA购自美国Sigma公司，mRNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、探针购自美国Life公司，DNA提取试剂盒购自德国Qiagen公司；DNA片段纯化试剂盒、pMD18®-T vector购自日本TaKaRa公司；ATP检测试剂盒购自杭州碧云天生物技术公司。

1.2 方法

1.2.1构建miR-19b沉默表达稳定株 P19细胞接种于6孔板，待细胞达到50%～60%融合度时进行转染。转染时，将miR-19b沉默及空载质粒(pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR-19b-knockdown、pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR-vector)按2 μg·孔-1的浓度转染P19细胞，6～8 h后换成完全培养液。待细胞长满后加入嘌呤霉素至终浓度为2 μg·ml-1，筛选单克隆，生成稳定株。

1.2.2双荧光素酶实验验证稳定株 根据miR-19b与Wnt1相结合的结果，克隆含miR-19b结合位点的Wnt1 3′非编码区(untranslated regions， UTR)，以此构建含Wnt1 3′UTR的荧光素酶报告基因质粒(Wnt1-Report)；定点突变该Wnt1 3′UTR中的核心序列(TTTGCAC)，构建含Wnt1 3′UTR突变体的荧光素酶报告基因质粒(Wnt1-Mut-Report)；构建miR-19b沉默质粒，与Wnt1-Report、Wnt1-Mut-Report分别或共转染P19细胞；检测荧光素酶活性的变化，验证miR-19b与Wnt1 3′UTR的结合作用。

1.2.3实时定量荧光PCR法检测细胞诱导分化关键基因变化 在转染后将细胞向心肌细胞诱导分化，分别在诱导分化的第0、4、6、8、10、12天抽提miR-19b沉默组与对照组总RNA，通过聚合酶链反应测定cTnT、NKX2.5、GATA4等基因的核酸表达量。以评价miR-19b沉默对P19细胞分化为成熟的心肌细胞的影响。采用探针荧光法，以β-肌动蛋白(β-actin)为内参，采用2-△△CT法计算关键基因的相对表达量：相对表达量=2[△CT(内参基因)-△CT(目的基因)]。

1.2.4检测诱导分化第10天检测细胞线粒体水平表达 在转染后将细胞向心肌细胞诱导分化，于第10天提取miR-19b沉默组与对照组细胞，检测细胞线粒体DNA(mtDNA)拷贝数、活性氧(reactive oxygen species，ROS)、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)的表达水平，以评价线粒体功能及其对细胞凋亡的影响。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 miR-19b沉默稳定株的成功建立

成功将质粒转染P19细胞后，通过荧光显微镜观察荧光表达反映转染效率(图1)，可见荧光表达逐渐增多。采用嘌呤霉素筛选单克隆，用双荧光素酶报告系统验证稳定表达细胞株。miR-19b沉默后荧光素酶活性得到了显著释放，解除了miR-19b对靶基因Wnt的抑制作用(图2)，证实了稳定株的成功建立。

图1 miR-19b荧光表达反映沉默与对照组细胞的转染效率(×100)

Fig 1 Transfection efficiency via GFP expression of the miR-19b knockdown vector and control vector in P19 cells(×100)

aP<0.05

图 2 双荧光素酶报告基因验证沉默稳定株的建立

Fig 2 The dual luciferase reporter assay system assessed the luciferase activity

2.2 miR-19b沉默对P19细胞向心肌样细胞分化的影响

为评价miR-19b沉默对P19细胞分化功能的影响，于普通倒置光镜下观察细胞形态学改变及成熟心肌细胞跳动情况，发现细胞在二甲基亚砜诱导下逐渐抱团并呈梭形心肌样细胞分化，跳动的细胞在miR-19b沉默组明显低于空白对照组(图3)；进一步应用实时定量荧光PCR检测cTnT、NKX2.5、GATA4标志基因。分别在诱导分化的第0、4、8、10、12天抽提总RNA，测定cTnT、NKX2.5、GATA4等基因的核酸表达量，结果发现，心肌分化相关标志基因cTnT在miR-19b沉默组中明显低于对照组，余基因无统计学意义的变化。可知，miR-19b沉默对心肌细胞分化过程中心肌细胞分化数量、标志基因表达均有明显影响，综合两种检查结果可认为miR-19b沉默可以抑制P19细胞向心肌细胞的分化进程(图4)。

图3 光镜下诱导分化P19细胞形态改变(×100)

Fig 3 Morphological appearance of differentiation of P19 cells(×100)

2.3 miR-19b沉默对心肌样细胞线粒体功能的影响

线粒体是真核细胞内的重要细胞器，为进一步确定miR-19b基因沉默后心肌细胞线粒体数和功能的变化情况，采用实时定量荧光PCR方法，以线粒体DNA特异性编码的基因细胞色素B(CytB)为检测指标，核基因28S为内参照，检测了miR-19b沉默组和对照组心肌细胞中线粒体DNA的相对含量。结果显示，miR-19b沉默的心肌细胞中，mtDNA拷贝数的相对含量高于对照空载组细胞，P<0.05，见图5。

以分子探针H2-DCFDA标记细胞内的活性氧，采用荧光显微镜及流式细胞技术对心肌细胞内活性氧进行定性和定量分析。结果显示，miR-19b沉默组心肌细胞中活性氧水平显著低于空载心肌细胞，P<0.01，见图6。

线粒体是所有真核生物进行能量代谢、产生三磷酸腺苷的重要场所，为进一步探讨miR-19b沉默基因对心肌细胞线粒体功能的影响，我们检测了诱导分化后的心肌细胞中的三磷酸腺苷含量。结果显示，miR-19b沉默显著增加了心肌细胞中的三磷酸腺苷生成，P<0.01，见图7。

3 讨 论

近来研究认为，miRNA与心脏发育及心血管疾病密切相关，同时miRNA也可以作为某些先天性心脏病检测标志物或治疗的靶标[3-4]，并且miRNA调控几乎参与了生物生命活动的各种生物学过程，且与恶性肿瘤的发生、转移及进展相关[5]。回顾研究未发现有关miR-19b与先天性心脏病相关的研究。本实验建立了miR-19b沉默表达的稳定细胞株，通过对稳定株的诱导分化，模拟心脏发育过程，以评价miR-19b在心脏发育中的功能。

在模拟心脏发育过程中，通过倒置光镜肉眼观察细胞诱导形态变化并进行拍照，可以见到第8天时，细胞团的大部分细胞出现生长抑制而死亡脱落，其周围可见大量梭形细胞，偶可见少量细胞跳动；第10天时，两组细胞中跳动细胞都明显增加。由于细胞出现生长抑制，诱导时间延长至第12天。为鉴定心肌样细胞发育情况，实验中选取检测心肌细胞的标志性基因cTnT、GATA4和NKX2.5的核酸表达量。NKX2.5是一种主要表达于心脏组织及心脏前体细胞的基因，有实验证实敲除NKX2.5小鼠的心脏发育停滞在循环形成阶段[6]。GATA-4属于心源性GATA亚系，它与NKX2.5均在心脏发育的起源和发展中发挥重要作用。有研究发现，NKX2.5和GATA-4可影响心脏发育[7]。实验中分别通过实时定量荧光PCR检测细胞分化第0、4、8、10、12天心肌标志基因的水平。诱导分化过程中，各基因在沉默组、对照组中均呈上升趋势，差异具有统计学意义，证明细胞诱导分化成心肌样细胞成功。而两组之间相比，miR-19b沉默组细胞中cTnT基因的核酸表达水平低于空白对照组，提示miR-19b沉默能抑制P19细胞向心肌样细胞分化。

同时实验中miR-19b沉默后可抑制心肌样细胞分化功能的同时，miR-19b抑制细胞凋亡。心肌细胞增殖与凋亡的平衡是心脏准确发育的前提[8]。过度的增殖或凋亡会打破原有心脏发育的平衡，直接或间接导致先天性心脏病的发生[9]。而细胞中的线粒体是决定细胞生存和死亡的重要细胞器。在哺乳动物的心肌细胞中存在大量的线粒体，线粒体功能产生变化将使产生凋亡的信号传递增加和放大，直接影响细胞的凋亡[10]，同时，细胞凋亡又会反作用于线粒体，促使线粒体结构和功能均发生动态改变[11-12]。

线粒体数目的多少一般用线粒体DNA拷贝数来表示，线粒体DNA可以作为反映线粒体功能的指标[13]。实验中检测miR-19b沉默后细胞内线粒体DNA拷贝数的表达，结果提示miR-19b沉默的心肌细胞中，线粒体DNA拷贝数的相对含量高于对照空载组细胞。线粒体功能受损时，细胞凋亡增多，同时生物体内的氧化代谢物增多，会产生氧自由基并在体内蓄积[14]，于是实验中采用分子探针H2-DCFDA标记细胞内的活性氧，对心肌细胞内活性氧进行定性和定量分析。结果显示，miR-19b沉默组心肌细胞中活性氧水平显著低于空载心肌细胞。众所周知，线粒体可产生能量提供给细胞和组织，并且心肌细胞的能量主要来源于线粒体生成的ATP[15]，当线粒体功能受损时，其生产ATP功能降低，心肌细胞能量供应不足，就可能导致心脏发育停滞，出现相关疾病的发生，因此可通过检测ATP的产量来反映线粒体功能。实验中应用生物发光法检测心肌细胞ATP的含量，结果显示，miR-19b沉默显著增加了心肌细胞中的ATP生成。根据线粒体DNA、活性氧、ATP结果可知，miR-19b沉默后线粒体功能受损程度降低，在一定程度上保护了心肌细胞。

aP<0.05

图4 心肌分化关键基因核酸表达量

Fig 4 Expression of myocardial cell molecular markers at various time points during the induction of differentiation

aP<0.05

图5 线粒体DNA表达水平

Fig 5 Levels of expression of mtDNA content

aP<0.05

图6 线粒体内活性氧表达水平 A.活性氧荧光表达； B.ROS定量表达

Fig 6 Effects of miR-19b knockdown on intracellular reactive oxygen species(ROS) content in differentiated cells

bP<0.01

图7 线粒体内ATP表达水平

Fig 7 Effects of miR-19b knockdown on intracellular ATP levels

综上所述，miR-19b沉默后抑制了心肌细胞的分化进程，同时又通过对线粒体的保护作用抑制心肌细胞的凋亡，说明miR-19b在心脏发育过程中起着至关重要的作用，也进一步说明该基因在先天性心脏病中也扮演着重要的角色。

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Effects of miR-19b knockdown on cardiac differentiation in mouse embryonic carcinoma P19 cells

LIU Xue-hua1，2，ZHU Sha-sha2，YU Zhang-bin2，ZHU Chun2，LI Meng-meng2，HAN Shu-ping2，HU Xiao-shan2，ZHU Jin-gai2，PENG Yu-zhu1，2

(1.NanjingMedicalUniversity，Nanjing210029，China； 2.DepartmentofPediatrics，NanjingMaternalandChildHealthHospitalofNanjingMedicalUniversity，Nanjing210004，China)

Objective:To explore the function of microRNA-19b(miR-19b) knockdown on differentiation in P19 cells. Methods: We transfect miRNA-19b knockdown plasmid and vector into P19 cells and stable cell lines were selected by puromycin and conformed by dual luciferase reporter gene system. Mitochondria function assays were adopted to analyze apoptosis respectively. Real time PCR detected P19 cell differentiation markers. Results: TargetScan 5.1 software and dual luciferase reporter gene system confirmed that Wnt1 was the target gene of miR-19b(P<0.05)；Expressions of all the marker genes gradually grew during the process of differentiation； the genes showed significantly lower degrees of expression in miR-19b-knockdow cells. Compared with the vector group， mtDNA copy number was significantly higher in the miR-19b knockdown group， so as to ATP levels. ROS levels in miR-19b-knockdown cells were much lower than those in control cells (allP<0.05).Conclusion: miR-19b knockdown could inhibit apoptosis and differentiation in P19 cells

microRNA-19b knockdown； P19 cell； mitochondria； differentiation

2015-05-07

2015-05-13

国家自然科学基金资助项目(81070500)；南京市卫生青年人才基金资助项目(QRX11107)

刘雪华(1988-)，女，江苏如皋人，在读硕士研究生。E-mail:snowsharif@163.com

彭宇竹 E-mail:pyz1131@hotmail.com

刘雪华，朱莎莎，余章斌，等.miR-19b沉默对P19细胞分化及线粒体功能的影响[J].东南大学学报：医学版，2015，34(5)：704-709．

R329.2

A

1671-6264(2015)05-0704-06

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.05.005