多聚赖氨酸与EDTA交联物对小鼠成纤维细胞的毒性研究*



多聚赖氨酸与EDTA交联物对小鼠成纤维细胞的毒性研究*

**通信作者 E-mail:jiany110@sina.com

网络出版时间：2015-04-20网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.50 12.R.20150420.1929.028.html

李英琦， 张海燕**

(贵阳医学院附院 眼科， 贵州 贵阳550004)

[摘要]目的： 观察多聚赖氨酸与乙二胺四乙酸(EDTA)的交联物(PLE)对体外培养的小鼠成纤维细胞 L929的毒性程度。方法： 小鼠成纤维细胞L929分为正常组、对照组、多聚赖氨酸组、PLE组和EDTA组，采用MTT法比较相同浓度下，EDTA、多聚赖氨酸与EDTA交联物对小鼠成纤维细胞L929相对增殖率的影响。结果： 以正常组作为标准(100%)，多聚赖氨酸组、EDTA组、PLE组和对照组对小鼠成纤维细胞L929的相对增殖度(RGR) 分别为 79.87%、69.35%、81.47%和20.12%，均较正常组下降，差异有统计学意义(P<0.05)；在质量浓度达为1 000 μmoL/L时，EDTA对小鼠成纤维细胞L929的毒性为2级，PLE和多聚赖氨酸对小鼠成纤维细胞L929的毒性为1级。结论： 实验浓度的PLE和EDTA对小鼠成纤维细胞 L929毒性较低，具有一定的安全性。

[关键词]多聚赖氨酸； 乙二胺四乙酸； 成纤维细胞； 细胞毒性

白内障是世界范围内主要的致盲眼病之一，随着我国人口的老龄化，有学者预计在2020年我国50岁及以上人群的患病比例约为25%。目前治疗白内障的唯一有效的方法就是通过手术来恢复视觉功能，但术后的后囊膜混浊(posterior capsular opacification，PCO) 是最常见并发症。PCO的出现亦可能引起患者再次发生视力障碍(又称后发性白内障)。现代白内障手术保留了囊袋， 囊袋由部分前囊和整个后囊组成， 起到隔离房水和玻璃体的作用，大部分囊袋内放置了人工晶状体。白内障术后剩余前囊膜的晶状体上皮细胞会顽固地残留，这些残留的晶状体上细胞(1ens cells，LEC)黏附、增殖、移行，导致后囊epithelial混浊。LEC需要黏附才能正常生长，细胞黏附的破坏可以致细胞凋亡。整合素是一类ca2+依赖的介导细胞间或细胞与基质间相互作用的黏附分子，维持正常细胞内外信号传导，其与细凋亡的关系密切。刘建亭研究发现，EDTA可破坏细胞间连接，减轻后囊膜混浊。张海燕等研究发现聚赖氨酸与乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetracetic acid,EDTA)的交联物(polylysine-EDTA,PLE)可显著降低兔PCO的发生率。本实验在体外培养的小鼠成纤维细胞 L929中加入PLE,观察其对细胞的毒性作用。

1材料和方法

1．1　材料

DMEM/1640(美国Sigma公司)， PBS片溶剂(美国Sigma公司)， 胰蛋白酶(美国Solarbio公司)，RPMI-1640培养基(美国GIBCO公司)， MTT(美国Solarbio公司)， EDTA(美国Sigma公司)，DMSO(重庆川东化工)，多聚赖氨酸( Poly-L-Lysine， 美国Sigma公司)，乙二胺四乙酸二钠(EDTA，湖南湘中地质实验研究所)。Olympus倒置显微镜CKX-41(日本，Olympus)，板式酶标仪ZS-2(北京，新风机电)，二氧化碳培养箱MCO-175(日本，三洋)，超净工作台BHC-1300(苏洲，安泰)。

1．2　方法

1.2.1实验分组小鼠成纤维细胞L929，购于第四军医大学实验动物中心，成纤维细胞分5组：正常组，加入1 000 μmoL/L的 DMSO细胞培养液；对照组，加入含1 000 μmoL/L的二甲基亚砜培养液；多聚赖氨酸组，加入含1 000 μmoL/L的多聚赖氨酸培养液；PLE组，加入1 000 μmoL/L的PLE培养液；EDTA组，加入1 000 μmoL/L的EDTA培养液。

1.2.2试验步骤参照使用说明书，利用EDC将EDTA与多聚赖氨酸结合起来，将所得PLE 40 mL (含2.687 mmoL/L EDTA) 放入冷冻干燥机中浓缩， 加蒸馏水至100.748 mL (含1 000μmol/L EDTA)，同时用5.6% NaHCO3调pH值至7。参照GB/T16886.5-ISO10993-5，将处于对数生长期的小鼠成纤维细胞L929 用质量浓度为2.5 g/L 的胰蛋白酶进行消化，制成终浓度为5×107/L 的细胞悬液，接种于96 孔培养板中，每孔100 μL。待细胞生长至亚融合状态时进行试验。于37 ℃、体积分数5% CO2环境下培养48 h后终止培养，在倒置显微镜下观察细胞生长状态，而后每孔加入新配制的5 g/L MTT液20 μL，继续培养4 h后，弃去孔中上清液，每孔加入二甲基亚砜150 μL溶解甲瓒沉淀，用微型超声振荡器震荡摇匀 10 min，使紫色培结晶充分溶解，在酶标仪上于490 nm波长下测定吸光值。

1.3　观察指标

根据测定的吸光值按下式计算相对增殖度(RGR)，并按表1的毒性分级标准对试验结果进行评估。RGR%=A试验组/A正常组×100%。

表1　毒性分级标准

1.4　统计学处理

试验数据采用用平均值±标准差表示。应用SPSS 13.0统计软件，采用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1　成纤维细胞的相对增殖度

由表2可知，以正常组作为标准(100%)，多聚赖氨酸组、EDTA组、PLE组、对照组对小鼠成纤维细胞L929 的相对增殖度(RGR) 分别为 79.87%、69.35%、81.47%和20.12%，均较正常组下降，差异有统计学意义(P<0.05)；多聚赖氨酸组、EDTA组、PLE组RGR值与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)；多聚赖氨酸组、PLE组之间RGR值比较无统计学意义(P<0.05)。

2.2　各试验组对成纤维细胞的毒性

EDTA对小鼠成纤维细胞 L929的毒性为2级，PLE和多聚赖氨酸对小鼠成纤维细胞 L929的毒性为1级。见表2。

3讨论

后发性白内障是因术后残留的前囊膜下及赤道部晶体上皮细胞，增殖转化为纤维细胞，并沿后囊膜迁徙，使晶状体后囊出现混浊。利用药物和免疫方法，抑制晶状体上皮细胞的增殖和纤维化反应，是预防后发性白内障研究中的热点。EDTA是一种常用的Ca2+螯合剂，它在水中溶解度高，不易透过细胞膜，相对无毒，分子量372道尔顿；在体外实验中常用于分离上皮细胞与基底膜。利用EDTA分散组织细胞的特性， Humphry等和 Nishi等实验证实，EDTA能够很好地松解晶状体上皮细胞；Bretton等[10]研究发现多聚赖氨酸可选择性地与晶状体囊膜结合；杨金玲等[11]将EDTA与多聚赖氨酸交联后特异性作用于晶状体囊，以达到有效地清除晶状体上皮细胞的目的。

表2　各实验组小鼠成纤维细胞L929

(1)与正常组比较，P<0.05；(2)与阳性对照组比较，P<0.01

细胞毒性试验大大减少了实验动物的使用量、测试时间较短、灵敏度较高、重现性较好，可以用于药物安全性的快速筛查和初步筛查。目前国内外一般使用MTT法和形态学观察法对药物的细胞毒性进行分析[12]。形态学观察法检测药物毒性最为常用，在显微镜下逐日观察细胞形态变化，药物浓度高对细胞有毒性时细胞会变圆、固缩性坏死和脱落，但此法主观性强，结果可靠性不高。目前MTT3(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐]比色法在体外肿瘤细胞化疗药敏试验的应用越来越广泛，成为评价药物安全的重要指标，检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO) 能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在一定波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量，此法优点是灵敏度高、经济。本试验分别采用MTT法，分析测定结果以评价PLE对小鼠成纤维细胞 L929 的毒性，结果显示，以正常组作为标准(100%)，多聚赖氨酸组、EDTA组、PLE组和对照组对小鼠成纤维细胞L929 的相对增殖度(RGR) 分别为 79.87%、69.35%、81.47%和20.12%，均较正常组下降，差异有统计学意义(P<0.05)；在质量浓度达为1 000 umoL·L-1时，EDTA对小鼠成纤维细胞 L929的毒性为2级，PLE和多聚赖氨酸对小鼠成纤维细胞 L929的毒性为1级。

本研究实验结果表明，PLE对细胞的生长增殖表现出良好的细胞相容性，其细胞相对增殖率较高而细胞毒性较低，具有一定的安全性。

4参考文献

[1] 娄尚.我国老年性白内障流行病学的调查研究.南昌大学学报：医学版, 2012(6):98-99,101.

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[9] Nishi O, Nishi K, Hikida M. Removal of lens epithelial cells following loosening of the junctionnal compex . J Cataract Refract Surg, 1993(1):56-61.

[10]Bretton RH, Swearingen A. Use of a polylysine-saprin conjugate to prevent posterior capsule opacification. J Cataract Refract Surg, 1999(7):921-929.

[11]杨金玲,张海燕,张苏炯,等.多聚赖氨酸与EDTA的交联物防治兔眼后囊膜混浊的研究.眼科研究, 2008(26):893-896.

[12]徐爱风,方玉,侯本祥.天然生物膜的细胞毒性的实验研究.北京口腔医学, 2004(1):30-31.

(2014-10-18收稿，2015-02-14修回)

中文编辑： 刘平； 英文编辑： 赵毅

Toxicity Study of Conjugates of PLL and EDTA on Mouse Fibroblast

LI Yingqi， ZHANG Haiyan

(OphthalmologyCenter,theAffiliatedHospitalofGuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the toxicity degree of PLE from EDTA and Poly-L-Lysine (PLL) on fibroblast L929 of mouse in vitro culture. Methods: Mouse fibroblast L929 were divided into normal group, control group, PLL group, PLE group and EDTA group, adopting MTT method to compare the effect of EDTA and PLE on proliferation of mouse fibroblast L929 under the same concentration. Results: Taking normal group as standard (100%), relative growth rate (RGR) of L929 in PLL group, EDTA group, PLE group and control group were 79.87%、69.35%、81.47% and 20.12%, lowered than normal group, differences were statistically significant (P<0.05). As the mass concentration reached 1 000 μmoL/L, toxicity of EDTA on fibroblast L929 reached level 2, PLE group reached level 1. Conclusions: Experiment concentration PLE and EDTA has minor toxicity on mouse fibroblast L929.

[Key words]poly-L-Lysine; ethylene diamine tetracetic acid; fibroblasts; cytotoxicity

[中图分类号]R776.1

[文献标识码]A

[文章编号]1000-2707(2015)04-0360-03

*[基金项目]贵州省科技厅攻关项目[黔科合OZ字(20092)]