致病性副猪嗜血杆菌的分离鉴定与药敏试验

周海勇

（山东省滨州市滨城区杨柳雪镇兽医站,山东滨州 256600）

致病性副猪嗜血杆菌的分离鉴定与药敏试验

周海勇

（山东省滨州市滨城区杨柳雪镇兽医站,山东滨州 256600）

副猪嗜血杆菌（haemophilus parasuis，Hps）是引起猪格氏病（Glassers’Disease）的致病菌，近年来随着我国养猪业的规模化、集约化发展，猪格氏病感染有明显增加趋势，给我国养猪业带来了巨大的经济损失[1-3]。目前，我国兽医临床中常使用抗菌药物进行细菌性疫病的预防控制，但抗菌药物的大量滥用，导致了耐药菌株的不断出现，对如何正确使用药物防控该病提出了更高的要求[4]。2014年春，山东省滨州某规模化猪场断奶仔猪突然发病，发病率高达20 %，死亡率达40 %，病猪精神沉郁、食欲减退直至禁食、体温升高、咳嗽、呼吸困难，站立困难甚至瘫痪，剖检病死猪可见胸膜炎、腹膜炎、脑膜炎、心包炎、关节炎等典型病理变化。根据临床症状和剖检诊断为疑似副猪嗜血杆菌感染，为进一步确诊，本研究进行了细菌分离与鉴定等实验室诊断，并对分离菌株进行了药敏试验，筛选出了对该致病菌比较敏感的几种药物，为发病猪场防控措施的制定提供了参考依据，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 病料来源

无菌采集7头病死猪心脏、脾脏和关节组织。

1.2 培养基、生化鉴定管、药敏片

胰蛋白大豆琼脂（TSA）和烟酰胺嘌呤二核苷酸（NAD）购自山东省荣成市雨林生物工程有限公司；新生牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司；细菌微量生化反应管和药敏纸片购于杭州天和微生物试剂有限公司。

1.3 细菌分离培养与纯化

无菌取7只病死猪的心脏、脾脏和关节组织分别划线接种于TSA平板（含0.001% NAD和5 %牛血清）37 ℃培养至48 h，观察菌落特征。取平板上的单个菌落再划线接种于相同培养基进行纯化培养。

1.4 形态学观察

挑取单个菌落进行革兰氏染色镜检，观察细菌形态。

1.5 卫星现象观察

取纯化菌落水平划线于血平板，再取葡萄球菌垂直于水平线划线，37 ℃培养至48 h，观察血平板上是否具有溶血和卫星生长现象。

1.6 生化鉴定

取分离菌株按常规方法分别进行葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、木糖、半乳糖、甘露醇、阿拉伯糖、尿素酶、吲哚试验、氧化酶试验、接触酶试验等生化鉴定试验。

1.7 致病性试验

取分离菌株增殖培养后，通过活菌计数调整菌液浓度使其成含菌量为109～1010CFU/ml悬浮液，分别经腹腔注射5只小鼠，同时取5只小鼠注射灭菌生理盐水作为对照。分别隔离饲养，观察7 d。

1.8 药敏试验

按常规方法分别测定分离菌株对常见10种药物的敏感性。

2 结果与分析

2.1 细菌分离培养与纯化结果

7份分离组织样品中有6份在含NAD和血清的TSA平板上长出的针尖大小、无色透明、边缘整齐菌落。将6株分离菌株经平板纯化后，菌落大小均一，均呈针尖大小、无色透明、边缘整齐。

2.2 形态观察结果

革兰氏染色后在显微镜下观察发现6株分离菌株均为革兰阴性菌，细小杆菌，有的为短杆状，有的则细长，以细杆状居多。

2.3 卫星现象观察结果

在葡萄球菌划线周围长出边缘整齐、无色透明的不溶血菌落，且具葡萄球菌越近，菌落越大，呈明显的卫星现象。

2.4 生化试验鉴定结果

生化试验鉴定结果详见表1，从表中可以看出，6株分离菌株均符合副猪嗜血杆菌的生化特性。

表1 6株分离菌株的生化特性

2.5 动物试验

6株分离菌株分别接种的5只小鼠中，有2株分离株死亡4只小鼠，4株分离株死亡5只小鼠，6株分离菌株的致死率均达到80 %以上，部分分离菌株的致死率已达到100 %，表明分离毒株均具有较强的致病性。

2.6 药敏试验结果

药敏试验结果详见表2。6株分离菌株对10种药物均存在不同程度的耐药性，其中对环丙沙星、甲氧苄啶最高。同时也筛选出红霉素、阿米卡星2种敏感药物。

表2 分离菌株对10药物的敏感性

3 讨论

副猪嗜血杆菌对营养和环境要求较严格，本研究采用含NAD和血清的TSA平板对7份临床组织病料进行了分离鉴定，共获得6株副猪嗜血杆菌，分离成功率达85.71 %。同时本研究采用贺云霞等[4]和王雪敏等[5]的试验方法，利用小鼠作为动物实验模型进行6株分离菌株的致病性研究，结果表明6株分离菌株均为致病性菌株，由此可以认为，致病性副猪嗜血杆菌是引起该猪场断奶仔猪死亡的主要病因。同时，本研究利用药敏试验筛选出了该猪场致病性副猪嗜血杆菌的红霉素、阿米卡星2种敏感药物，为及时进行药物防治进行了科学指导，以减少该病造成的经济损失。

[1] 苗立中，李书光，胡琳琳. 副猪嗜血杆菌病发病概况及诊断方法[J].动物医学进展，2014，35（6）：144-148.

[2] 王建，邵卫星，吕占军，等. 2012年我国部分省市规模化猪场副猪嗜血杆菌分离鉴定及菌株血清分型[J].动物医学进展，201435（3）：52-56.

[3] 林双喜，李云. 成功控制保育猪副猪嗜血杆菌病的案例分析[J].养猪，2013，（6）：123-125.

[4] 贺云霞，徐慧，叶飞，等. 副猪嗜血杆菌15个血清型标准分离株对小鼠毒力的研究[J].黑龙江畜牧兽医，2011，（9）：90-91.

[5] 王雪敏，路明华，陈小玲，等. 副猪嗜血杆菌的分离鉴定及相关特性研究[J].中国畜牧兽医，2014，41（5）：211-215.