荷斯坦奶牛HSP 70-1基因多态性与热应激的关联性

吴珑韬， 曹涵文， 潘建东， 甘乾福， 石沈炳， 梁学武*

(1.福建农林大学 动物科学学院， 福建 福州 350002； 2.福建省建阳市吉翔牧业有限公司， 福建 福州 354200)



荷斯坦奶牛HSP70-1基因多态性与热应激的关联性

吴珑韬1， 曹涵文1， 潘建东2， 甘乾福1， 石沈炳2， 梁学武1*

(1.福建农林大学 动物科学学院， 福建 福州 350002； 2.福建省建阳市吉翔牧业有限公司， 福建 福州 354200)

为我国南方荷斯坦奶牛抗热应激品种的选育提供理论依据，使用PCR-SSCP方法，对327头荷斯坦奶牛HSP70-1基因编码区进行单核苷酸多态性检测，并分析其与热应激的关联性。结果表明：HSP70-1基因在1112位点发生C→A突变，有CC、CA和AA基因型，其中CA型个体血清三碘甲腺原氨酸(T3)显著低于其他基因型个体(P<0.05)，甲状腺素(T4)显著低于AA型个体(P<0.05)，直肠温度显著低于CC型个体(P<0.05)；在3390位点发生T→C突变，有TT、TC和CC基因型。1112位点的皮质醇(Cor)及3390位点各指标基因型间差异均不显著(P>0.05)。CA型个体对抗热应激的能力更强，1112多态位点可以作为提高奶牛抗热应激能力的一个潜在遗传标记。

热应激蛋白70； 单链构象多态性； 血生化； 直肠温度

夏季高温高湿气候条件是制约我国南方奶牛业发展的一个重要因素。由于高产奶牛代谢旺盛，并且皮肤汗腺不发达，当处于热应激时奶牛直肠温度上升、脉搏及呼吸频率加快[1]；采食量下降，使机体营养摄入量减少，内分泌机能紊乱，导致产奶量明显降低，并且牛奶中乳脂率、乳糖率、乳蛋白率也会下降，严重的热应激会引起奶牛休克、死亡[2]；热应激会降低公牛的精子活力，对受精率也有很大影响[3]。因此，选育抗热应激能力强的奶牛品种对于发展南方奶牛业具有重要意义。

热应激蛋白70(HSP70)是一种分子伴侣蛋白，在奶牛发生热应激反应时起重要的保护作用。在不良环境因素的影响下，HSP70能够保护机体，使动物适应环境的变化。HSP70能增强机体的热耐受能力、维持细胞内环境稳定，在提高抗氧化能力、免疫应答等方面也有重要作用[4]，HSP70基因表达水平与热应激强度和持续的时间呈正比关系[5]。HSP70基因的多态性会影响热应激条件下影响血清超氧化物歧化酶(T-SOD)、丙二醛(MDA)等的浓度[6]。目前，南方夏季高温高湿气候条件给奶牛业生产造成的影响研究集中于合理建造、改造牛舍，改善日粮以及生理代谢分析等方面，对于奶牛个体基因差异以及适应力的研究较少[7]。为此，笔者于2014年7月使用PCR-SSCP方法，对327头荷斯坦奶牛HSP70-1基因进行多态性检测，分析了HSP70-1基因多态性与血液生化指标及奶牛直肠温度的关联性，为我国南方荷斯坦奶牛抗热应激品种的选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物及试剂

动物：荷斯坦奶牛327头，胎次1～6胎，均来自福建省建阳市吉翔牧业。试剂：Taq PCR Mastermix、血液基因组DNA提取试剂盒，均购自北京天根生化科技有限公司；血液三碘甲腺原氨酸(T3)、甲状腺素(T4)、皮质醇(Cor)试剂盒，均购自北京北方生物技术研究所。

1.2 基因组DNA提取及PCR扩增

于2014年7月10—11日尾静脉采血10 mL，使用 ACD抗凝剂保存于-20℃冰箱。用DNA提取试剂盒提取DNA。根据NCBI登录(登录号：AY 149619.1)的荷斯坦奶牛HSP70-1基因设计2对引物(表1)，由上海生工生物科技有限公司合成。PCR反应体系(20 μL)：Taq PCR Mastermix 10 μL，H2O 8 μL，DNA模板1 μL，上下游引物各0.5 μL。PCR条件：94℃预变性5 min；94℃变性40 s，57℃和61℃退火30 s，72℃延伸35 s，38个循环；72℃延伸7 min。PCR产物保存于4℃冰箱。

表1 荷斯坦奶牛HSP70-1基因的PCR引物

1.3 PCR产物检测及测序

PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳，判断目的条带是否清晰。取PCR产物3 μL与变性上样缓冲液8 μL混合，98℃变性10 min，立即置于冰上放入-20℃冰箱中冷却10 min，上样，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳条件为90V、时间13 h，银染显色。使用凝胶成像系统拍照，判断是否具有特异性目的条带。发现有特异性条带的样品，由上海生工生物科技有限公司进行测序，使用BLAST软件进行序列比对。

1.4 直肠温度及血清指标含量测定

于7月8—11日连续4天14:00左右使用兽用体温计测定奶牛直肠温度，同时在牛舍8个位置离地面2 m处放置干湿温度计，分别测定牛舍温湿度，计算平均值和温湿指数(THI)。

THI=0.72(T1+T2)+40.6

式中，T1、T2分别表示干湿温度计上干、湿球度数。血清三碘甲腺原氨酸(T3)、甲状腺素(T4)、皮质醇(Cor)按试剂盒说明书测定。

1.5 数据统计分析

使用软件Excel统计基因频率和基因型频率，对等位基因的哈代-温伯格平衡性进行卡方检验。对基因型效应分析建立一般线性模型：

Yijm=μ+Ti+Gj+eijm

式中，Yijm表示个体表型记录，Ti为胎次效应，Gj为标记基因型效应，eijm为随机误差。使用软件SPSS 20进行HSP70-1多态位点基因型与血清生化指标、直肠温度的关联分析，结果用平均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 牛舍温湿指数

经测定，7月8—11日的平均气温分别为34.3℃、33.7℃、36.1℃和35.7℃，温湿指数(THI)分别为86.25、86.32、88.26和86.68。Fuquary J W等[8]研究表明，当7290时奶牛处于严重热应激。由此表明，试验奶牛处于中度热应激状态。

2.2 PCR产物及多态性

PCR扩增产物经过1%琼脂糖电泳，分别在247 bp和216 bp位置出现清晰条带(图1)。根据银染结果和测序结果判断，引物P1产物在1112位点存在C→A突变，形成CC、CA和AA基因型(图2～4)，基因型频率分别为66.9%、28%和5.1%，C为优势等位基因(表2)；引物P2产物在3390位点存在T→C突变，形成TT、TC和CC基因型(图2～4)，基因频率分别为63.7%、30.8%和5.5%，T为优势等位基因(表2)。从表3看出，1112和3390突变位点的多态信息含量分别为0.261 3和0.251 9，均属于中度多态。经卡方检验，2个多态位点均符合Hardy-Weinberg平衡。

注：M为100 bp Ladder DNA marker，1～10为扩增产物。

Note: M, 100 bp DNA marker; 1～10, amplification products.

图1 PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱

Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR products

图2 P1和P2扩增片段聚丙烯酰胺电泳凝胶银染图谱

图3 P1 PCR扩增产物测序结果(从上至下分别是CC、CA和AA型)

图4 P2 PCR扩增产物测序结果(从上至下分别是TT、TC和CC型)

表2 荷斯坦奶牛1112和3390位点的基因频率和基因型频率

表3 基因座位点的群体遗传特征

表4 突变位点与血清生化指标浓度和直肠温度的关联性

注：同位点同列不同字母表示差异显著(P<0.05)。

Note: Different letters in the same column indicate significance of difference at 0.05 level.

2.3HSP70-1基因多态位点与血清生化指标和直肠温度的关联性

从表4看出，1112多态位点与血清T3浓度、T4浓度及直肠温度存在显著相关，并且CA型个体的血清T3含量显著低于CC型和AA型，血清T4含量显著低于AA型，CC型和CA型个体的直肠温度均显著低于AA型，皮质醇各基因型间差异均不显著。3390多态位点与所测项目无显著相关。

3 结论与讨论

3.1HSP70-1基因多态性对奶牛热应激血清参素的影响

甲状腺分泌的T3、T4可以提高基础代谢，增加产热，促进蛋白质合成，且T3比T4具有更强的生物活性。奶牛处于热应激时，甲状腺代谢能力下降，T3、T4分泌量降低以减少自身产热来对抗热应激对机体的损害[9]；在热应激状态下，不同泌乳阶段奶牛血清的T3、T4浓度均低于非热应激期[10]。陈强等[11]研究表明，奶牛HSP70基因作为抗热应激选育的分子标记不太理想，这可能与其样本量小有关。研究结果表明，荷斯坦奶牛HSP70-1基因1112位点的CA型个体血清T3浓度低于其他型个体，并且直肠温度低于CC型和显著低于AA型个体(P<0.05)，表明CA型个体对抗热应激的能力更强，1112多态位点可以作为提高奶牛抗热应激能力的一个潜在遗传标记，但还需要扩大样本和检测HSP70蛋白表达水平来进一步验证。

皮质醇是由肾上腺皮质分泌的一类激素，可以促进糖、脂肪和蛋白质分解，使血糖浓度增加[12]。目前，关于皮质醇在热应激时期的变化报道不一，一般认为，急性热应激会使血清皮质醇升高，慢性热应激时下降。荷斯坦奶牛HSP70-1基因2个多态位点血清皮质醇浓度CC、TC基因型个体最低，但与其他基因型个体间差异均不显著。

3.2HSP70-1基因多态性对直肠温度的影响

直肠温度是判断奶牛是否处于热应激状态的重要指标，奶牛直肠温度遗传力在0.25～0.65，在热应激状态下直肠温度较低的奶牛具有更强的抗热应激能力[13]。李建国[14]等认为，可以将奶牛直肠温度作为判断是否处于热应激的依据。研究结果表明，荷斯坦奶牛HSP70-1基因1112位点CA型个体直肠温度显著低于其他基因型个体，说明CA型个体在夏季高温时具有更强的抗热应激能力。

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(责任编辑： 冯 卫)

Relationship Between Heat Stress and Polymorphism ofHSP70-1 Gene in Holstein Cow

WU Longtao1, CAO Hanwen1, PAN Jiandong2, GAN Qianfu1, SHI Shenbing1, LIANG Xuewu1*

(1.CollegeofAnimalSciences,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou,Fujian350002; 2.JixiangAnimalHusbandryLimitedCompany,Fuzhou,Fujian354200,China)

The relationship between heat stress and polymorphism of HSP70-1 gene was studied by analyzing single nucleotide polymorphism in HSP70-1 coding sequence of Holstein cow by pcr-sscp to provide the theoretical basis for breeding of Holstein cow with resistance to heat stress in Southern China. Results:There is C→A mutation (CC, CA and AA genotypes) on 1112 locus of HSP70-1 gene. T3, T4and rectal temperature of the individuals with CA genotype are lower than other individuals with other genotypes, individuals with AA genotype and individuals with CC genotype significantly. There is T→C mutation (TT, TC and CC genotypes) on 3390 locus of HSP70-1 gene. There is no significant difference in Cor on 1112 locus and different indexes on 3390 locus between different genotypes. The 1112 polymorphism locus can be used as a potential genetic marker to improve resistance to heat stress of Holstein cow because individual with CA genotype has of strong resistance to heat stress.

heat stress protein 70; single-stranded conformation polymorphism (SSCP); blood biochemistry; rectal temperature

2014-12-30； 2015-02-28修回

科技型中小企业技术创新基金项目“南方荷斯坦奶牛高产耐热新品系建立与培育”(13C26213502913)；福建省科技计划项目“南方荷斯坦奶牛高产耐热新品系的繁育与示范 ”(2014S0069)

吴珑韬(1990-)，男，在读硕士，研究方向：动物营养与饲料科学。E-mail：wulongtao789@qq.com

*通讯作者：梁学武(1960-)，男，教授，从事反刍动物营养研究与生产工作。E-mail：faulxw2000@163.com

1001-3601(2015)05-0259-0153-04

S823

A

畜牧·兽医·水产

Animal Husbandry·Veterinary·Fishery