封闭负压引流对兔放射性溃疡创面愈合的影响

龚震宇，冯小艳，熊锐华，詹 球，李小龙

封闭式负压引流技术(vacuum-assisted closure，VAC)是近年来兴起的一种促进创面愈合的新型治疗方法，是通过将吸引装置与伤口敷料连接后，使创面维持在负压状态下，起到促进创面愈合的作用。它是由Fleischmann首创的可控制全创面高负压持续引流演变而来，目前被广泛运用到各种急慢性创面的治疗与促进创面愈合中［1］。放射性皮肤溃疡(radiation ulcer)是常见的皮肤损害，临床上主要是由肿瘤的放射性治疗、意外放射照射事故引起。随着肿瘤放射治疗的广泛开展，临床上放射性溃疡发生率逐年增加。一旦溃疡形成，若不及时处理会造成溃疡加深、出血、感染等危害，甚至危及患者的生命。放射性溃疡的治疗正越来越受到临床医生关注［2］。笔者采用兔放射性溃疡模型，观察了VAC对兔放射性溃疡创面组织愈合的影响，旨在为探讨VAC促进难愈性创面愈合的作用机制提供理论基础，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选择16只清洁级新西兰白兔作为研究对象，由解放军第一八一医院动物实验中心提供，体质量2.0～2.5 kg，饲养时控制温度在(22.6±2.3)℃，湿度在(60.5±5.0)%。按随机数字表法分为2组，其中，对照组8只，雌3只，雄5只，平均体质量(2.2±0.2)kg;实验组8只，雌4只，雄4只，平均体质量(2.3±0.3)kg。2组白兔均在相同环境下用相同份量的饲料饲养。

1.2 设备及试剂 武汉维斯第医用科技股份有限公司提供的封闭负压引流治疗系统，通过电脑控制的压力装置产生持续负压;北京医研所生产的BJ-6B直线加速器;Promega公司生产的RT-PCR试剂盒扩增MMP-1、MMP-2、TIMP-1和TIMP-2;成纤维细胞生长因子(bFGF)和血管内皮生长因子(VEGF)试剂盒购自晶美生物工程(北京)有限公司。

1.3 兔放射性溃疡模型制作及处理 每只兔均单笼喂养，后臀部剃毛，未使用硫化钠脱毛。24 h后确认脱毛区无损伤后接受照射。照射前采用3%戊巴比妥钠静脉注射麻醉，剂量30 mg/kg。照射范围为兔后臀部约直径5cm圆形皮肤。1次照射剂量为35 Gy，造成深Ⅱ度创面模型。照射条件:BJ-6B直线加速器(北京医研所)，6 MV高能X射线，源皮距100cm，准直器:直径5cm。剂量率300 cGy/min。皮肤外加盖1.3cm有机玻璃片，以使照射最大吸收剂量位于皮肤处。照射后各组兔均正常单笼喂养。照射后14 d创面出现后，按照分组，分别采用VAC治疗及常规包扎，直至创面取材或创面愈合。

1.4 实验观察指标及方法

1.4.1 创面肉眼观察及愈合时间 肉眼观察创面肿胀及分泌物情况，观察创面坏死组织清除及肉芽组织的生长情况;记录创面愈合时间，愈合时间即创面完全上皮化所需的时间。

1.4.2 创面组织基质金属蛋白酶与金属蛋白酶组织抑制剂mRNA的测定 在实验前、损伤后第3、第7和第14天均取溃疡中央肉芽组织进行处理。MMP-1、MMP-2和 TIMP-1反应条件均为60℃下1 min，68℃下2 min和68℃下7 min，TIMP-2 反应条件为52℃下1 min，68℃下2 min和68℃下7 min，每项检查均行30个循环，产物均于1.2%琼脂糖上观察电泳情况，经扫描系统测定密度值。

1.4.3 血清生长因子含量测定 在实验前、损伤后第3、第7和第14天采用ELISA法检测白兔血清bFGF和VEGF的含量，检测过程严格按照试剂盒的要求进行。

2 结果

2.1 2组创面肉眼观察及愈合时间比较 实验组创面采用VAC处理后，肉眼观察可见创面肿胀及分泌物与对照组比较明显得到控制，创面坏死组织的清除与肉芽组织的生长也比对照组也明显加快;实验组创面平均愈合时间为(16.3±2.6)d，对照组创面平均愈合时间为(20.4±3.7)d，组间比较，差异具有统计学意义(t=2.357，P＜0.05)。

2.2 2组创面组织基质金属蛋白酶与金属蛋白酶组织抑制剂mRNA的表达比较 实验前2组创面MMP-1和MMP-2 mRNA的表达比较，分别t=0.824和t=0.737，均P＞0.05，差异无统计学意义;而损伤后第3、第7和第14天创面 MMP-1和 MMP-2 mRNA的表达比较，均P＜0.05，差异具有统计学意义，实验组均显著低于对照组(表1);实验前2组创面TIMP-1和TIMP-2 mRNA的表达比较，分别t=0.688和t=0.596，均P＞0.05，差异无统计学意义;而损伤后第3、第7和第14天创面TIMP-1和TIMP-2 mRNA的表达比较，均P＜0.05，差异具有统计学意义，实验组均显著高于对照组(表2)。

表1 实验组和对照组创面组织基质金属蛋白酶mRNA的表达比较(±s)

表1 实验组和对照组创面组织基质金属蛋白酶mRNA的表达比较(±s)

注:与对照组比较aP＜0.05

组别 动物数MMP-2实验前 损伤后第3天 损伤后第7天 损伤后第14天 实验前 损伤后第3天 损伤后第7天 损伤后第14天MMP-1对照组 8 83.4±12.3 66.3±10.2 54.7±9.2 36.5±7.5 79.4±10.9 62.7±9.8 49.6±8.9 34.2±6.8实验组 8 84.6±12.9 51.6±9.5a 42.8±8.6a 29.7±6.4a 80.3±11.6 50.4±9.1a 39.7±8.2a 25.3±6.1a

2.3 2组血清细胞因子表达比较 实验前2组血清bFGF和VEGF的表达比较，分别t=0.406和t=0.669，均P＞0.05，差异无统计学意义;而损伤后第3、第7和第14天血清bFGF和VEGF的表达比较，均P＜0.05，差异具有统计学意义，实验组均显著高于对照组(表3)。

3 讨论

目前，皮肤放射性损伤临床上主要由X线、γ射线及β射线一次大剂量或反复多次照射引起。损伤的程度因射线的剂量、种类不同而有差别，X线、γ射线均可引起电离辐射，而电离辐射能够将能量传递给如蛋白质、DNA等生物大分子，导致分子结构与活性的改变，也可通过产生的自由基损伤生物分子［3］。皮肤表皮细胞及附属器对各种射线均较为敏感，受到射线照射后会出现一系列的变化，引起皮肤破溃，并逐渐发展为放射性溃疡。放射性溃疡在显微镜下显示具有较少的肉芽组织以及成纤维细胞，增生细胞的粗面内质网较少并发生破裂、扩张;线粒体可出现肿胀空化，微管微丝减少，各种细胞器明显减少;周围组织内浸润的浆细胞发生变性，毛细血管内皮细胞因增生而导致血管腔狭窄;溃疡底部及周围纤维组织因胶原变性而出现玻璃样变性，同时放射性溃疡周围成纤维细胞的数量及合成能量均下降。这些都导致了皮肤放射性溃疡伤口收缩不良以及愈合延迟［4-5］。

VAC通过封闭的类似吸盘装置以及相关管道做负压吸引治疗，负压直接作用于溃疡创面，增加了创面局部血流量，激活了创面细胞的活性。同时持续的负压吸引作用于创面，还可及时吸出创面的渗液，防止因创面渗液积聚形成细菌培养基，且持续的负压吸引增加了创伤处细胞的张力，起到了机械性牵引的作用，利于创面的愈合［6-7］。目前研究认为，VAC通过以下机制促进创面愈合［8-12］:(1)促进创面局部微循环和肉芽组织生长。创面长期不能愈合多是由于创面局部血供不佳，导致创面组织氧代谢不足。在缺氧的环境下，创面局部组织会出现代谢紊乱，抑制了局部组织细胞的增殖。VAC由于去除了局部组织过多的液体，缓解了局部水肿，对周围组织小血管的压迫得以解除;同时负压下细小动脉会扩张，增加了细胞的有丝分裂，加强了创面周围微血管的增生，有效降低了血管后负荷，溃疡局部血流得以恢复，这又促进了创面的愈合;VAC还可促进肉芽组织形成。肉芽组织的形成可为上皮组织生长提供条件，利于创面愈合;(2)减轻局部组织水肿。局限性水肿既起到压迫创面局部血管与淋巴系统，增加创面的皮肤张力的作用;还能够起到加重创面局部微血管后负荷，减少皮瓣血液供应增加的作用，这些均对创面的愈合产生不良影响。VAC的负压系统可有效去除创面渗出物与坏死组织，能够有效减少周围组织间压力和组织间液体的积聚，因而降低了周围血管的通透性，缓解了组织水肿;(3)促进创面细胞增殖及抑制凋亡。VAC可在创面形成一种机械应力，这种力在降低创面张力的同时也可通过细胞骨架与细胞膜传导至细胞内，最终将信号传导至细胞核。这促进了生长因子的合成与分泌，如PG、蛋白激酶C、磷酸肌醇和Ca2+等，这些生长因子通过作用诱导了成纤维细胞、表皮细胞、血管内皮细胞等组织细胞增生、蛋白产物合成及血管生成，促进了创面的愈合;(4)抑制细菌繁殖，清除坏死物质。溃疡创面延迟愈合甚至不愈合往往与创面感染相关，同时细菌竞争性消耗了局部组织修复所需要的氧气与营养，局部大量细菌繁殖也改变了创面微环境，这对正常组织细胞的生长起到了抑制作用，最终造成创面的不易愈合。VAC可令创面保持封闭状态，对外来细菌及有害微生物有效隔离，避免了细菌的交叉感染;封闭所营造的低氧环境也对细胞增殖起到抑制作用，引流也促进了创面细菌、坏死物及渗出物的清除，破坏了利于细菌生长的环境，显著降低了创面细菌感染率。

表2 实验组与对照组创面组织金属蛋白酶组织抑制剂mRNA的表达比较(±s)

表2 实验组与对照组创面组织金属蛋白酶组织抑制剂mRNA的表达比较(±s)

注:与对照组比较aP＜0.05

组别 动物数TIMP-2实验前 损伤后第3天 损伤后第7天 损伤后第14天 实验前 损伤后第3天 损伤后第7天 损伤后第14天TIMP-1对照组 8 26.3±6.4 35.2±7.1 54.5±7.8 76.5±8.7 31.6±7.6 44.3±8.1 60.2±8.8 83.6±9.8实验组 8 25.7±6.1 46.3±7.7a 63.6±8.3a 84.3±9.5a 30.3±7.3 56.2±8.8a 75.4±9.3a 96.4±10.7a

表3 实验组与对照组血清细胞因子表达比较(ng/L，±s)

表3 实验组与对照组血清细胞因子表达比较(ng/L，±s)

注:与对照组比较aP＜0.05

组别 动物数 成纤维细胞生长因子(bFGF)血管内皮生长因子(VEGF)实验前 损伤后第3天 损伤后第7天 损伤后第14天 实验前 损伤后第3天 损伤后第7天 损伤后第14天对照组 8 0.64±0.21 1.06±0.35 1.48±0.69 1.92±0.84 1.32±0.64 1.47±0.64 1.64±0.92 2.03±1.04实验组 8 0.67±0.23 1.33±0.42a 2.07±0.81a 2.65±1.02a 1.35±0.68 1.83±0.82a 2.23±1.08a 2.96±1.12a

基质金属蛋白酶家族(MMPs)与金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)是调节胶原代谢的主要酶类，MMPs是一类活性依赖于金属锌离子的蛋白酶，是降解I、II、III型胶原的关键酶，对创面的胶原降解起着重要作用，MMPs的活性主要受到TIMPs的抑制，TIMPs能够减少胶原的过度降解，TIMPs不足可导致创面不愈合。MMPs与TIMPs在创面的愈合过程中均起到了十分重要的作用［13］。bFGF能够直接作用于成纤维细胞与血管内皮细胞上的特异性受体，促进这类细胞发生分裂增殖，bFGF能够促进毛细血管的增生，改善创面局部的微循环与营养状况，增加肉芽组织的沉积，促使其由创缘向中心的爬行，起到加速创面修复进程的作用。VEGF是目前已知作用最强的促血管生成细胞生长因子，能够选择性地作用于内皮细胞(EC)，促进EC的迁移与增殖，加快创面局部新生血管的形成，从而促进创面的愈合［14-15］。笔者通过临床观察证实，与未采用VAC相比，创面肿胀及分泌物得到明显控制，创面坏死组织的清除与肉芽组织的生长明显加快;平均愈合时间明显缩短(P＜0.05);同时损伤后3d、7d和14d创面组织MMP-1和MMP-2 mRNA的表达明显减少(P＜0.05)，TIMP-1和TIMP-2 mRNA的表达明显增加(P＜0.05);血清bFGF和VEGF的表达明显升高(P＜0.05)，这均说明了VAC对兔放射性溃疡创面组织的愈合起到积极的促进作用。

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