细菌GYZC02株的鉴定及抗血栓的活性研究

张 健， 李 锵， 王伦兴， 王召贺， 杨再昌,2*

(1.贵州大学贵州省发酵工程与生物制药重点实验室,贵州贵阳 550025；

2.贵州大学药学院,贵州贵阳 550025)



细菌GYZC02株的鉴定及抗血栓的活性研究

张 健1， 李 锵1， 王伦兴1， 王召贺1， 杨再昌1,2*

(1.贵州大学贵州省发酵工程与生物制药重点实验室,贵州贵阳 550025；

2.贵州大学药学院,贵州贵阳 550025)

[目的]鉴定细菌GYZC02株，并研究其抗血栓活性。[方法]利用形态学特征、生化试验和16S rRNA 序列同源性比较鉴定菌株，通过小鼠断尾试验和小鼠尾动脉血栓模型验证GYZC02发酵液的抗血栓活性。[结果]根据形态学、生化试验和16S rDNA 序列测定结果，该菌株鉴定为枯草芽孢杆菌。通过灌胃给药发现，GYZC02发酵液乙酸乙酯萃取物能明显延长小鼠断尾出血时间，抑制小鼠尾动脉血栓的形成，表明该细菌具有抗血栓活性。[结论]枯草芽孢杆菌GYZC02发酵液的小分子物质具有抗血栓活性。

GYZC02；鉴定；抗血栓活性

血栓栓塞性疾病是引起死亡的主要原因之一，据世界卫生组织统计，全球每年有大约1 500万人死于血栓栓塞性疾病，我国每年的发病人数约为1 000万，病死人数有100万，致残率也很高[1-2]。血栓性疾病的药物治疗手段包括抗凝治疗、抗血小板药物治疗和溶栓治疗，但是现有药物均存在各方面的问题，如价格昂贵、不易保存、具有出血等副作用[3]，因此研发新型抗血栓药物具有重要意义。迄今为止，关于细菌次生代谢产物具有抗血栓活性的报道尚不多见。笔者一直致力于从微生物中发现抗血栓药物，从土壤样本中筛选到1株细菌，其发酵液的乙酸乙酯萃取物具有抗血栓活性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1菌株。GYZC02菌株分离自贵阳市花溪区农用地土壤。

1.1.2试剂。角叉菜胶购自Sigma公司，尿激酶为南大药业有限公司产品，其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3液体培养基。葡萄糖 15 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，Na2HPO33 g，CaCl20.06 g，MgSO40.3 g，纯净水1 000 ml,pH 7.0，121 ℃，灭菌20 min。

1.2 细菌鉴定

1.2.1生理生化特征。参照文献[4-5]的方法进行生理生化特征鉴定。

1.2.216S rRNA 基因序列分析。将斜面保藏的菌种活化，接种到种子液培养，37 ℃摇床培养24 h，用试剂盒提取细菌基因组DNA。扩增采用的引物正向引物为5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(27F),反向引物为5′-GGTTACCTTGTTACGACTT -3′(1492R)。PCR 反应体系(20～50 ng/μl)：在94 ℃预变性4 min，进入循环扩增阶段93 ℃变性45 s，57 ℃复性45 s，72 ℃延伸1 min，循环30次，最后在72 ℃保温10 min。反应结束后，PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测、回收，并进行序列测定。所测序列用Blast软件与GeneBank数据库中已登录的16S rRNA序列进行比对，并用MEGA5软件进行系统进化树的构建,从而确定GYZC02菌株的同源性。

1.2.3细菌致病性试验。取细菌GYZC02株发酵液(1×108CFU/ml)0.5 ml，给8只健康小白鼠灌胃，同时用生理盐水作为对照(n=8)，观察15 d,记录小鼠的病理变化及死亡数。

1.3 抗血栓活性测定

1.3.1小鼠断尾出血时间的测定。昆明小鼠(28 g)，购自贵阳医学院实验动物中心。将小鼠分为2组：①治疗组8只，用生理盐水配制GYZC02发酵液的乙酸乙酯萃取物，浓度为100 mg/ml，每只小鼠灌胃0.5 ml,每日灌药1次，用药5 d后测定小鼠断尾出血时间；②正常组：8只，灌生理盐水。按照文献[6]方法测定小鼠断尾出血时间。

1.3.2抗小鼠尾动脉血栓试验。小鼠尾动脉血栓模型参照文献[7]方法复制。将小鼠分为4组：①治疗组:8只，用生理盐水配制GYZC02发酵液的乙酸乙酯萃取物，浓度为100 mg/ml，每只小鼠灌胃0.5 ml,每日灌药1次；②模型组：8只，灌生理盐水；③阳性药组：8只，尿激酶用生理盐水配成10万单位/ml，每只小鼠腹腔注射0.5 ml，每日1次；④正常对照组：8只，为不造模的正常小鼠。所有小鼠在相同的情况饲养，用药2 d后，除正常对照组外，每只小鼠腹腔注射0.2%的角叉菜胶0.5 ml，48 h后观察3组小鼠尾动脉血栓形成情况， 记录尾动脉形成血栓的小鼠数，计算血栓形成率(%)，并测量小鼠尾血栓长度(cm)。

2 结果与分析

2.1 生理生化特征鉴定在普通琼脂划线培养24 h 后，菌落呈白色，不透明，隆起，边缘不整齐，表面粗糙、干燥，不易挑起；革兰氏染色呈紫色，为革兰氏阳性菌；在液体培养基中培养24 h 后，轻度浑浊，无沉淀，表面形成菌膜。菌株GYZC02的主要生理生化特征与枯草芽孢杆菌基本保持一致。

对菌株GYZC02 的16S rRNA 基因序列进行扩增并测序，其序列为1 454 bp。将所测序列与GenBank上已登录的同属16S rRNA序列进行比对。从图2可以看，GYZC02菌株与登录号为GU826165的菌株BacillussubtillisBL10(枯草芽孢杆菌)的同源性最高，达到100%。

根据GYZC02菌株的菌落、细菌形态和生理生化特性，结合16S rRNA进行序列比对结果，将GYZC02菌株鉴定为枯草芽孢杆菌。

灌胃试验发现，小鼠15 d无死亡，处死小鼠后解剖未见任何病理变化，表明该菌株无致病性。

小鼠断尾试验表明，治疗组和阴性组小鼠断尾试验出血时间出现明显差异。治疗组小鼠出血时间明显高于阴性对照组，治疗组小鼠的出血时间达到(13.9±1.8)min，而阴性组的血时间仅有(4.6±0.9)min，说明GYZC02发酵液的乙酸乙酯萃取物明显延长了小鼠断尾出血时间，具有明显的抗凝效果。

从图3可以看出，腹腔注射角叉菜胶后，小鼠形成了明显的尾动脉血栓，尾尖变黑。由表1可知，模型组、治疗组和阳性药组小鼠尾动脉血栓阳性率分别为75.0%、62.5%和37.5%，模型组、治疗组和阳性药组的尾动脉血栓长度分别为(1.27±0.23)、(0.56±0.13)和(0.60±0.10)cm，表明GYZC02菌株的次生代谢产物能明显抑制小鼠尾动脉血栓的形成，抗血栓药效与阳性药基本一致。

表1 小鼠尾动脉血栓形成率和尾动脉血栓长度

3 讨论

微生物在地球上分布广泛、品种众多，其次生代谢产物解构丰富，是药物的重要来源。人类需要通过动、静脉血管和毛细血管供血维持其正常生理功能，如果出现血栓就会引起相关组织或器官供血不足，造成功能紊乱而导致疾病，严重时可危及生命[8-9]。该试验表明分离的细菌GYZC02为枯草芽孢杆菌，其发酵液的乙酸乙酯萃取物具有抗血栓形成活性。

该菌株的次生代谢产物能延长小鼠断尾出血时间，表明具有抗凝活性；通过先给药再造模的方法，该菌株的次生代谢产物能阻断小鼠尾动脉血栓形成，表明具有抗血栓形成的活性。此外，在前期体外溶栓试验中还发现该菌株的次生代谢产物具有一定的溶栓能力。

微生物溶栓活性很早就受到重视，已经证实一些细菌和真菌能够产生溶栓酶。但是有关细菌的小分子在抗血栓方面的研究并未受到重视，GYZC02发酵液的乙酸乙酯萃取物以小分子为主，酶难以被乙酸乙酯萃取，即使能被部分萃取，经过80 ℃蒸干，其结构也已经被破坏，因此可断定GYZC02菌株的抗血栓活性物质为小分子化合物。 该研究丰富了微生物抗血栓方面的内容，为开发新型抗血栓药物奠定了基础。后续研究应进行活性跟踪分离及作用机制探讨，相关工作正在进行中。

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Identification of Bacteria Strain GYZC02 and Study on Its Antithrombotic Active Substances

ZHANG Jian1, LI Qiang1, WANG Lun-xing1, YANG Zai-chang1,2 *et al

(1. Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biopharmacy of Guizhou Province, Guizhou University, Guiyang, Guizhou 550025; 2. School of Pharmacy, Guizhou University, Guiyang, Guizhou 550025)

[Objective] To identify bacteria strain of GYZC02 and study its antithrombotic activity. [Method] Morphological characteristic, biochemical test, and 16S rRNA sequence homology were used to identification of GYZC02 strain. The mouse tail bleeding time and arterial thrombosis model were used to assay the antithrombotic activity of GYZC02. [Result] The results of morphological, biochemical test, and 16S rRNA sequences revealed that the strains is a kind ofBacillussubtilis. By oral administration, the ethyl acetate extract GYZC02 broth could significantly prolong the bleeding time, and inhibit the formation of mouse tail artery thrombosis. [Conclusion]BacillussubtilisGYZC02 can produce small molecules with high antithrombotic activity.

GYZC02; Identification; Antithrombotic activity

贵州省社会发展科技攻关项目(SY字[2013]3058号)；国家自然科学基金(81460531)。

张健(1987-)，男，贵州毕节人，硕士研究生，研究方向：生物制药。*通讯作者，教授，博士，硕士生导师，从事具有生物学活性的天然产物的筛选工作。。

2014-11-24

S 852.6

A

0517-6611(2015)02-120-03