猪囊尾蚴西昌分离株线粒体Cytb和nad4基因的序列测定与种系发育分析

郝桂英（西昌学院，四川西昌615013）



猪囊尾蚴西昌分离株线粒体Cytb和nad4基因的序列测定与种系发育分析

郝桂英
（西昌学院，四川西昌615013）

摘 要：利用PCR技术对2个猪囊尾蚴西昌分离株的线粒体细胞色素b（Cytb）基因全序列和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚单位4（nad4）基因部分序列（pnad4）进行扩增，分析其遗传变异，并用MEGA 5.0程序NJ法绘制种系发育树，探讨不同地区来源的猪囊尾蚴种系发育关系。测序结果显示，2个猪囊尾蚴分离株的Cytb基因全序列长度均为1 068bp，nad4基因部分序列长度均为815bp，核苷酸序列同源性均为99.8%。种系发育分析结果显示，所有猪囊尾蚴分离株形成一个分支，2个西昌分离株均属于猪带绦虫亚洲基因型。结果表明，Cytb和nad4基因均可用于猪带绦虫的分子分类，为猪带绦虫病/猪囊尾蚴病的分子诊断奠定基础。

关键词：猪囊尾蚴；Cytb基因；nad4基因；种系发育

猪囊尾蚴（Cysticercus cellulosae）是猪带绦虫（Taenia solium）的中绦期，寄生于猪、人等的肌肉、脑、眼等处，引起囊尾蚴病［1］。该病呈世界性分布，是一种危害严重的人兽共患寄生虫病，在中国、印度、印尼、泰国、老挝、柬埔寨、尼泊尔、菲律宾、缅甸、越南、韩国、肯尼亚、坦桑尼亚、墨西哥等国家广泛流行［2-3］。我国东北、西北、东部和南部等地感染率均较高［4］。猪带绦虫病/猪囊尾蚴病仍然是全世界不可忽视的公共卫生问题［5］。

猪带绦虫及其中绦期在形态上与其他2种带绦虫（牛带绦虫、亚洲带绦虫）很难区分，同时由于受自然、地理等生态环境因素的长期影响，寄生虫种、株间发生不同程度的遗传分化，这些变化很难用形态学方法所区分。DNA序列分析比形态学方法具有更强的鉴别力，可精确测量生物自然种群的遗传变异程度，是目前进行物种遗传变异、分子分类和分子种系发生等研究的主要手段之一，为寄生虫的准确鉴定和系统学研究提供了有力的工具，弥补了传统分类方法的不足。国内外已有不少学者应用DNA序列分析对世界不同地区猪带绦虫分离株进行分子鉴别和基因分型［6-9］。

细胞色素b（Cytb）基因是物种间高度保守的一个线粒体基因［10］，近年被用于带科绦虫的系统进化分析，也是最早用于猪带绦虫病分子诊断［11］和基因型分析的基因之一［6］。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚单位4（nad4）基因是线粒体上进化速率较快的基因，但目前还没有用于猪带绦虫分子鉴别和基因分型的报道。

本研究对四川省西昌市2个猪囊尾蚴分离株的线粒体Cytb基因全序列和nad4基因部分序列（pnad4）进行PCR扩增和序列分析，并应用两者重构猪带绦虫的种系发育关系，为猪带绦虫病/猪囊尾蚴病的分子诊断奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1猪囊尾蚴的采集 从四川省西昌市某肉联厂屠宰的2只感染有猪囊尾蚴的猪只的肌肉，剥离出囊尾蚴，用无菌生理盐水清洗3次，分别标记为XC1和XC2，并放于-20℃保存备用。分离自同一只猪的囊尾蚴为1个分离株。

1.1.2主要试剂 2×Taq PCR MasterMix、柱式DNA胶回收试剂盒，天根生化科技（北京）有限公司产品；DNA Marker，宝生物工程（大连）有限公司产品。

1.1.3引物设计 以GenBank上已发表的猪带绦虫（T.solium）线粒体全基因组（GenBank登录号：AB086256）为模板分别设计2对引物。引物序列分

别为CytbP1：5′-AAACTGATAGATTGTGGTTC-3′，CytbP2：5′-ATATGACTRTCWTTAGAAGA-3′；pnad4P1：5′-TTAGTGAGTCTCCTTATTCTGA-3′，pnad4P2：5′-ACACACTCATAACACTCCC-3′。引物序列由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。

1.2方法

1.2.1猪囊尾蚴基因组DNA的提取 用蛋白酶K消化和酚/氯仿法［12］提取猪囊尾蚴基因组DNA，保存于-20℃备用。

1.2.2线粒体Cytb和nad4基因的扩增、纯化与序列测定 以提取的猪囊尾蚴基因组DNA为模板进PCR扩增。PCR扩增体系为50μL：2×Taq PCR MasterMix 25μL，引物P1、P2（10pmol/L）各2μL，模板DNA 2μL，ddH2O 19μL，混匀后瞬时离心15s。同时，以ddH2O代替模板DNA作空白对照。Cytb扩增条件：95℃5min；95℃30s，48℃45s，72℃1min，共30个循环；最后72℃5min。pnad4扩增条件：95℃5min；95℃30s，48℃30s，72℃ 45s，共30个循环；最后72℃5min。反应结束后分别取5μL PCR扩增产物进行10g/L琼脂糖凝胶电泳。各PCR扩增产物经柱式DNA胶回收试剂盒进行回收纯化，送英潍捷基（上海）贸易有限公司测序。

1.2.3数据分析 检索GenBank收录的所有不同国家/地区的猪带绦虫的Cytb基因全序列和nad4基因序列并下载（表1）。用Clustal X 1.81软件对目标序列进行排序比对，生成供系统发育分析的矩阵。用MEGA 5.0软件检查序列是否出现终止子、碱基插入/缺失，计算序列碱基含量和差异、转换/颠换比率，并基于K2P模型计算遗传距离；用DNA Star软件中的MegAlign程序进行序列同源性分析。

以带科棘球属的细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus）（GenBank登录号：NC＿008075）作为系统发育分析的外群，采用K2P模型，用MEGA 5.0软件构建NJ树，并进行重复1 000次的自举检验（bootstrap test）。

表1　不同来源的猪带绦虫的线粒体Cytb和nad4基因序列信息Table 1 Information of mitochondrial Cytb and nad4genes of T.soliumfrom different countries

2　结果

2.1Cytb基因全序列和pnad4序列的特征及同源性

经比对校正后，2个猪囊尾蚴西昌分离株的Cytb基因全长1 068bp，不存在碱基插入/缺失。保守位点1 066个，变异位点2个，发生在密码子的第2位和第3位。R（si/sv）平均值为348.967，仅有转换位点（1个T-C和1个A-G），无颠换位点。A、T、C、G碱基的平均含量分别为23.7%、46.3%、9.2%、20.8%。2个测序序列核苷酸同源性为99.8%，遗传距离0.002；与已知猪带绦虫同源基因的核苷酸序列同源性为97.8%～99.8%，与带属其他绦虫同源基因的同源性低于86.0%。

2株猪囊尾蚴的pnad4序列长度均为815bp（占全长的67%），无碱基插入/缺失。保守位点813个，仅2个变异位点，发生在密码子的第2位和第3位，均为T-C的转换，R（si/sv）平均值为111.58。A、T、C、G碱基的平均含量分别为22.3%、48.5%、8.2%、21.0%。2个测序序列核苷酸同源性为99.8%，遗传距离0.002；与已知猪带绦虫（AB086256）同源基因的核苷酸序列同源性分别为99.5%和99.8%，与带属其他绦虫同源基因的同源性低于85.0%。

2.2种系发育分析

基于Cytb基因全序列构建的种系发育树显示不同地域的猪带绦虫分离株位于同一支，能与豆状带绦虫（T.pisiformis）、泡状带绦虫（T.hydatige-

na）、多头带绦虫（T.multiceps）、牛带绦虫（T.saginata）、亚洲带绦虫（T.asiatica）、肥头带绦虫（T. crassiceps）、带状带绦虫（T.taeniaeformis）很好地鉴别，且有效地区别出亚洲和非洲/拉丁美洲2种基因型猪带绦虫（图1）。XC1和XC2位于亚洲基因型分支上，说明2个西昌分离株属于亚洲基因型。但马达加斯加分离株在亚洲基因型分支和非洲/拉丁美洲基因型分支上均有分布。基于nad4基因部分序列构建的种系发育树显示猪带绦虫分离株单独形成1个分支，能与带属其他绦虫鉴别开（图2）。

图1　基于Cytb基因全序列NJ法构建的不同地域猪带绦虫的种系发育树Fig.1 Phylogenetic tree of T.soliumfrom different regions based by Cytb gene complete sequence on neighbor-joining analyses

3　讨论

猪囊尾蚴病被列为市场肉品检疫的必检项目，也是公认的社会经济病之一［13］。四川省凉山州17个县（市）均有不同程度的猪囊尾蚴病发生，尤以彝族聚居的昭觉、美姑、普格等县的边远高寒山区感染率高，感染强度大［14］。目前还缺少关于该地区猪带绦虫分子鉴定和基因分型的报道。

图2　基于nad4基因部分序列NJ法构建的不同地域猪带绦虫的种系发育树Fig.2 Phylogenetic tree of T.soliumfrom different regions based on nad4gene partial sequence by neighbor-joining analyses

本研究扩增了四川省西昌市2个猪囊尾蚴分离株的Cytb基因全序列和nad4基因部分序列，序列分析表明，2个分离株的碱基序列存在较小差异，Cytb基因全序列和nad4基因部分序列碱基差异均为0.02%。这与Gasser R B等［15］研究结果一致，他们认为不同猪带绦虫分离株间的线粒体DNA（mtDNA）分子标记具有很小甚至没有遗传变异。Nakao M等［7］报道13株分离自亚洲（中国、泰国、印尼和印度）、拉丁美洲（墨西哥、秘鲁、厄瓜多尔、玻利维亚和巴西）和非洲（坦桑尼亚、莫桑比克和喀麦隆）的猪囊尾蚴Cytb基因全序列中有31个碱基变异（占全长的2.9%），构建的进化树将其分为亚洲基因型和拉丁美洲/非洲基因型。且2个基因型的Cytb差异为1.6%～2.1%。他们认为Cytb基因不仅能区分猪带绦虫、牛带绦虫和亚洲带绦虫，还能区分猪带绦虫的2个基因型，是比cox1基因更适用于近缘种系统进化关系分析和种内变异分析的分子标记。Martinez-Hernandez F等［16］研究结果证实线粒体基因是比核基因更适于作为研究猪带绦虫变异的分子标记，他们发现cox1、Cytb和nad比5.8S+ITS1+ 18S、LMWA1和LMWA2具有更高的多态位点和信息位点比例。Palafox-Fonseca H等［17］对分离自墨西哥的12位脑囊虫患者的28个分离株的Cytb基因进行分析，发现均属于非洲/拉丁美洲基因型。

通过对2个猪囊尾蚴西昌分离株的Cytb基因全序列和nad4基因部分序列的分析和同源性研究，揭示猪带绦虫的Cytb基因和pnad4基因种内保守，差异较小，但种间差异较大，均可作为鉴别猪带绦虫的种间遗传标记。基于Cytb基因全序列构建的种系发育树显示2个西昌猪囊尾蚴分离株均属于亚洲基因型猪带绦虫。

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Sequencing and Phylogenetic Analysis of Mitochondrial Cytb Gene and nad4 Gene of Cysticercus cellulosae Xichang Isolates

HAO Gui-ying
（Xichang College，Xichang，Sichuan，615013，China）

Abstract：The complete sequences of mitochondrial cytochorome b（Cytb）gene and the partial sequences of NADH dehydrogenase subunit 4gene（pnad4）of 2 C.cellulosae samples isolated from Xichang were amplified by PCR，and sequenced to analyse their genetic variations，NJ phylogenetic trees were reconstructed using the MEGA version 5.0software.The results showed that the complete sequence of Cytb gene and partial sequence of nad4gene of C.cellulosae were 1 068bp and 815bp，respectively.The nucleotide sequence homology was 99.8%in two isolates based on Cytb gene and nad4gene.The phylogenetic trees showed that all the C.cellulosaeisolates were formed a single cluster，and the two Xichang isolates belong to Asian genotype.The results indicated that Cytb gene and nad4gene can be used to molecular classification of Taenia solium，and established the foundation for molecular diagnosis of taeniasis/cysticercosis. Key words：Cysticercus cellulosae；Cytb gene；nad4gene；phylogenetic relationship

作者简介：郝桂英（1980-），女，四川自贡人，副教授，博士，主要从事动物寄生虫病学研究。

基金项目：四川省高校重点实验室基本科研业务费项目（纵341B）

收稿日期：2014-08-16

中图分类号：S852.734；S858.28

文献标识码：A

文章编号：1007-5038（2015）05-0059-05