朱槿花苞提取物治疗皮肤疖痈溃疡及其机制研究

姜霁洋，徐 涵，白雪婷，程，林艳玲，凌 震，陈一村，石刚刚

（汕头大学医学院药理学教研室，广东汕头 515041）

朱槿花苞提取物治疗皮肤疖痈溃疡及其机制研究

（汕头大学医学院药理学教研室，广东汕头 515041）

中国图书分类号：R-332；R282．71；R284．1；R632.053.1

摘要：目的 研究朱槿花苞提取物对小鼠皮肤疖痈溃疡模型的治疗作用，并对其可能作用机制进行探讨。方法 将昆明小鼠分为模型组、阳性药组和朱槿花苞正丁醇萃取物（HrBN）组，采用小鼠疖痈模型，观察给药后实验结果。将昆明小鼠分为模型组、阳性药组和HrBN低、中、高剂量组，采用小鼠全层切除模型，观察给药后实验结果。通过体外抗菌实验检测朱槿花苞提取物抗菌MIC和抑菌圈。通过碳粒廓清实验测定朱槿花苞提取物对小鼠巨噬细胞廓清作用的影响，计算K和α值。结果 HrBN对疖痈溃疡修复效果明显，并呈现量效关系。HrBN、朱槿花苞乙酸乙酯萃取物（HrBE）及AB-8树脂体积分数0.3乙醇段、0.6乙醇段的抗菌作用明显。HrBN及朱槿花苞乙醇提物（HrBA）高剂量能够增加K和α值。结论 HrBN在动物实验中体现了良好的皮肤疖痈溃疡修复作用，其疗效与抗菌活性和免疫增强作用可能有关。

关键词：朱槿花苞；正丁醇萃取物；疖痈模型；全层缺失模型；抗菌；碳粒廓清

网络出版时间：2015－7－22 10：42 网络出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150727．0901．015．html

1　材料与方法

1．1材料

1．1．1实验动物 SPF级昆明小鼠，体质量18～22 g，♀♂各半，购于汕头大学医学院实验动物中心。恒温恒湿饲养。

1．1．2供试菌株 标准金黄色葡萄球菌ATCC29213和铜绿假单胞菌ATCC27853由汕头大学医学院附一医院检验科赠送，恒温隔水培养箱中35℃过夜培养，使用无菌生理盐水配制为0．5麦氏浓度菌液。抗菌实验所使用器具均经高温高压无菌处理。

1．1．3仪器与试剂 上海亚荣生化仪器厂RE-5203旋转蒸发仪，上海浦东荣丰科学仪器公司101A-1型烘箱，沈阳誉德电子仪器公司电脑自动脱水机，广州先尼仪器公司Nikon显微镜，恒温细菌培养箱，苏州净化设备公司超净台，Molecular Device酶标仪SpectraMax M2e 200-100，ZHENGDAER-5758剃毛器。AB-8大孔树脂，体积分数为0．95乙醇（西陇化工有限公司），乙酸乙酯（西陇化工有限公司），氯仿（天津市富宇精细化工有限公司），正丁醇（西陇化工股份有限公司），DMSO（西陇化工有限公司），质量浓度为4 g·L－1多聚甲醛，巴豆油（Sigma公司），松节油（广州新港化工厂），一得阁墨汁，肝素（江苏万邦生化医药股份有限公司），百多邦软膏（中美史克有限公司），盐酸左旋咪唑（广东华南药业有限公司）。

1．1．4药材与药物 朱槿花苞采摘于汕头大学医学院花圃，并经广州中医药大学中药学院鉴定。鉴定人：广州中医药大学中药学院药用植物教研室彭光天博士。鉴定植物为锦葵科木槿属朱槿Hibiscus rosa-sinensis Linn。

取鲜药500 g，剪碎，1.5 L体积分数0.7～0.8乙醇80℃加热1h后过滤，重复2次，加入1.5 L乙醇加热30 min后过滤，合并滤液，于旋转蒸发仪上45℃蒸干，得朱槿花苞乙醇提取物（HrBA）。将醇提物配制为质量分数0.03的水溶液，按1∶1相比分别使用正丁醇、乙酸乙酯萃取7～8次，分别于旋转蒸发仪上浓缩蒸干得HrBN、HrBE浸膏。

AB-8大孔树脂经体积分数为0.95乙醇及HCl溶液、NaOH溶液预处理后，用大量纯化水洗净后湿法装柱。加朱槿花苞醇提液（150 g·L－1）于柱顶，以1 mL·min－1的流速进行动态吸附，吸附平衡后，同等流速下先使用适量水洗脱，再使用2BV体积分数分别为0.3乙醇液、0.6乙醇液、0.95乙醇液洗脱，收集各段洗脱液，于旋转蒸发仪上浓缩即得各洗脱产物浸膏。

2.2.1 病虫灾害防治要求 有机农业植物保护在有机产品的生产及加工规定中，不能在植物栽培过程中使用化学农药，并要求严格控制基因工程产品的使用，限制使用石灰及波尔多液等含有真菌的化学农药。另外，推荐在有机农业植物保护中使用醋、乙醇或软皂等环保物质；倡导利用小黑隐翅甲等害虫天敌防治办法，或采用展板等捕杀害虫的工具。

1．2方法

1．2．1实验模型 在药理实验肉芽肿模型的基础上［7］，改良疖痈动物模型：小鼠腹腔注射质量浓度100 g·L－1水合氯醛（0.4 mg·g－1）麻醉，背部褪毛（3 cm×3 cm），使用含体积分数0.002巴豆油的松节油合剂，1 mL胰岛素注射器于每只小鼠背中部脊椎处皮内注射0.06 mL，以出现白色疖痈伴红肿，且脓包上切面高出周围皮肤1～2 mm为造模完成标准。

全层切除皮肤创伤模型［8］：小鼠腹腔注射质量浓度100 g·L－1水合氯醛（0.4 mg·g－1）麻醉，背部褪毛（3 cm×3 cm），医用酒精清洁小鼠皮肤，使用直径4 mm的打孔器于小鼠背部脊椎处切除同样直径的圆形皮肤组织，以露出筋膜为准。

1．2．2朱槿花苞正丁醇萃取物（HrBN）对疖痈模型小鼠作用研究 昆明小鼠30只，♀♂各半，随机分为模型组、百多邦组、HrBN组（150 g·L－1），每组10只。造模3 h后于造模疖痈处给药1次，分别涂抹溶剂0.3 mL、百多邦约0.2 g、HrBN药液0.3 mL，造模次日记录为给药d 1，d 1～3每日给药2次，d 4 ～9每日给药1次，共用药9 d，d 10观察康复情况。

1．2．3HrBN对创伤溃疡模型小鼠作用研究 昆明小鼠150只，♀♂各半，随机分为模型组、百多邦组、HrBN低、中、高浓度组（40、80、160 g·L－1），每组30只。采用全层切除小鼠模型，造模3 h后于造模创伤处给药1次，分别涂抹溶剂0.3 mL，百多邦约0.2 g，HrBN低、中、高浓度药液0.3 mL，造模次日记录为给药d 1，d 1～3每日给药2次，d 4～9每日给药1次，共给药9 d，d 10观察各组创口修复情况。

1．2．4皮肤样本组织切片观察 各组小鼠于d 10观察康复情况后处死，取造模处皮肤肉芽组织或瘢痕组织（约1 cm2）于包埋盒中，用质量浓度为40 g ·L－1多聚甲醛固定24 h，后用0.1 mol·L－1的PBS液冲洗浸泡，冲水后进行脱水、石蜡包埋、切片、HE染色、镜检，分别在×4倍和×40倍显微镜下摄取图像，观察皮肤组织样本纵切面结构。

1．2．5朱槿花苞提取物抗菌作用研究 采用肉汤常量稀释法测定各提取物对两种菌株的最低抑菌浓度（MIC）。实验组：HrBA、HrBN、HrBE、AB-8柱水段，使用体积分数0.05的DMSO溶剂配制600 g· L－1药液，取AB-8柱体积分数0.3乙醇段、0.6乙醇段配制160 g·L－1药液，取朱槿花苞鲜药捣烂得汁液（原汁液），加红糖捣烂得红糖原汁液。对照组：体积分数0.05的DMSO溶剂，红糖对照组：600 g· L－1红糖溶液。阳性药组：苯唑西林250 mg·L－1和头孢他啶4 000 mg·L－1。各组药液均经0.22 μm无菌滤器过滤后使用。向96孔板中分别加入肉汤培养液、菌液和供试药物，从1号孔至10号孔依次进行倍比稀释，将96孔板置于35℃恒温培养箱中，18 h后观察。

分别取两菌株接种于MH琼脂培养基上，每个培养基上均匀放置4个牛津杯，杯中注入20 μL各提取物药液。HrBN、HrBE、AB-8柱体积分数0.3醇段、0.6醇段药液，浓度均为100 g·L－1，且各组药液均经0.22 μm无菌滤器过滤，将培养皿放置35℃恒温培养箱内，20 h后观察。

1．2．6朱槿花苞提取物对免疫细胞碳粒廓清作用研究 昆明小鼠60只，♀♂各半，随机分为对照组（CMC混悬液）；盐酸左旋咪唑组（0.03 mg·g－1，浓度1.5 g·L－1）；HrBA低剂量（0.3 mg·g－1，浓度20 g·L－1），高剂量（0.6 mg·g－1，浓度40 g· L－1）；HrBN低剂量（0.3 mg·g－1，浓度20 g· L－1），高剂量（0.6 mg·g－1，浓度40 g·L－1）。以上各组均灌胃给药，每天1次，每次0.015 mL· g－1，连续给药10 d，末次给药后0.5 h，每只小鼠尾静脉注射经稀释的碳粒墨汁0.01 mL·g－1，于5min（t1）和15 min（t2）后分别从眼眶静脉丛取血20 μL，加到1.5 mL质量浓度1 g·L－1Na2CO3溶液中震荡摇匀，使用酶标仪在680 nm下检测OD（OD1和OD2）值。小鼠处死后摘取肝、脾，测量肝、脾重，按照公式K＝（logOD1－logOD2）／（t2－t1），α＝体重／肝、脾重×K1／3，计算廓清指数k和吞噬指数α。

2　结果

2．1HrBN对疖痈模型小鼠的影响 肉眼观察结果显示，对比模型组，HrBN可明显促进造模处疖痈康复，见Fig 3A。组织切片镜检显示，对比模型组，HrBN可有效减小疖痈创口宽度和加速坏死组织清除，且×4倍镜下观察造模处修复良好，见Fig 3B。×40倍镜HrBN组可见较多新生肉芽组织、新生毛细血管和较少的炎症细胞和坏死组织等，见Fig 3C。采用药效等级评分法［9］，分为康复、有效、进步和无效4级，给药9 d后评分结果显示，HrBN组分数明显高于模型组（P＝0.014，P＜0.05），结果见Fig 1。

Fig 1 Score of boils and carbuncles recovery

2．2HrBN对全层切除模型小鼠的影响 肉眼观察结果显示，对比模型组，实验组可明显促进皮肤修复，见Fig 4A。组织切片镜检结果显示，HrBN可明显减小创口的深度和宽度，×4倍镜检图像见Fig 4B。×40倍镜检可见HrBN组上皮组织修复完好以及可见新生肉芽组织和毛细血管等，见Fig 4C。给药9 d后各组进行药效等级评分［9］，HrBN组药效评分分数均高于模型组，低、中、高3浓度实验组药效分数呈递增趋势，3组间差异具有显著性（P＝0.039，P＜0.05），其中高浓度组药效分数明显高于低浓度组（P＜0.05）。模型组、百多邦组、HrBN低、中、高浓度组康复率分别为7.14%、24.14%、20%、30%、46.67%，经卡方检验P＝0.013，各组康复率差异有显著性，且药效随药物浓度增加具有量效关系，结果见Fig 2。

Fig 2 HrBN chart of dose-recovery rate

2．3朱槿花苞提取物对金葡菌和绿脓杆菌的影响

Tab 1 Results of anti-staphylococcus aureus

Tab 2 Results of anti-pseudomonas aeruginosa

实验结果显示，AB-8柱体积分数0.3乙醇段对金黄色葡萄球菌的抑制作用效果明显，其MIC相对较小，结果见Tab 1。HrBE对铜绿假单胞菌的抑制作用最为明显，其MIC相对较小，结果见Tab 2。金葡菌抑菌圈结果显示：①HrBN抑菌圈较小，②HrBE无明显抑菌圈，③AB-8柱体积分数0.3乙醇段抑菌圈明显，④AB-8柱体积分数0.6乙醇段抑菌圈明显，但小于③。抑菌圈图见Fig 5A。铜绿假单胞菌抑菌圈结果显示：（A）HrBN可见抑菌圈，（B）正丁醇水部位未见抑菌圈，（C）HrBE抑菌圈明显，（D）AB-8柱体积分数0.6乙醇段可见抑菌圈，但小于（C）。抑菌圈图见Fig 5B。

2．4正丁醇萃取物对巨噬细胞碳粒廓清指数和吞噬指数的影响 实验结果显示，与对照组相比，HrBN在300、600 g·L－1浓度下可明显提高吞噬细胞碳粒廓清指数K和吞噬指数α（P＜0.05）。HrBA 在300、600 g·L－1浓度下对比对照组，可提高吞噬细胞碳粒廓清指数K和吞噬指数α（P＞0.05）。结果见Tab 3。

Tab 3 Results of carbon clearance test（±s，n＝10）

Tab 3 Results of carbon clearance test（±s，n＝10）

*P＜0.05 vs control

Group　Weight index／mg·g－1　　α　K／10－2Control　2．511±0．618　4．378±1．541　1．691±1．238 Positive control　2．777±0．331　4．548±0．8797　2．059±1．029 HrBA 300 g·L－12．673±0．540　5．263±0．5027　2．444±1．032 HrBA 600 g·L－12．524±0．449　5．011±0．6617　2．561±1．001 HrBN 300 g·L－12．587±0．614　5．455±0．8843*　2．623±0．9862*HrBN 600 g·L－12．916±0．337　5．469±0．6325*　2．712±0．5241*

3　讨论

疖痈为皮肤及其附属器官感染细菌而引起的病症，溃疡为皮肤或黏膜组织缺失或溃烂病症，均为常见皮肤疾症，临床多使用抗生素如百多邦等防治感染。相对西医疗法，中医药发挥了相对的优势，中药除了防治感染还能够控制炎症、疼痛及促进组织再生等。《周礼》有“疡医下士八人，掌肿疡、溃疡之祝药覿杀之齐。”研究显示，部分中药及其外用制剂能够有效缓解模型动物创伤处的炎症和疼痛［10］。且有研究者总结不少单味中药同时具有抗菌消炎、去腐生肌的作用［11］。

Fig 4 Pictures of full-thickness loss model mice

Fig 5 Pictures of inhibition zone

疖痈症研究多采用皮内注射一定浓度菌液而形成的动物模型，此模型重现了由细菌感染所致的皮肤疖痈症，但是其所含菌种较为固定和单一，与自然形成的疖痈有一定差异。且在预试实验中，采用此动物模型出现了若干问题，一是造模12～24 h后未出现明显疖痈脓肿，二是造模12 h后小鼠出现大量死亡。相对而言，本实验使用的化学合剂刺激引起的疖痈模型，不仅较好模拟了疖痈脓肿，并且降低了死亡率，所感染的菌种与自然形成疖痈相似，均不固定。本实验采用经典的全层切除溃疡模型，此模型可用于研究皮肤组织的再生和修复，本实验的操作环境均为自然环境，因此较好地模拟了伴有一定感染的创伤溃疡，且可同时考察药物的皮肤修复作用。

中药发挥疗效往往是从多个方面共同达到治愈疾病的目标，且1种药材尤其花类药材可同时具有多个活性，如常见药材玫瑰花除美白、抗氧化之外，其中的多酚类物质还能够有效地对抗疲劳［12］。现今中药外用作用研究已涵盖抗菌、促进血液循环、增强免疫功能等多方面［11］。实验结果显示，AB-8树脂体积分数0．3醇、0．6醇段、HrBN、以及HrBE具有较好抗菌活性，HrBN的MIC大于AB-8树脂体积分数0．3醇段，但动物实验中发挥最佳疗效的却是正丁醇萃取物。由此可知抗菌作用可能是其作用机制之一，但不是主要作用机制。碳粒廓清实验结果显示，HrBN在低、高剂量下均提高了巨噬细胞廓清能力，证明朱槿花苞免疫增强作用也可能是其作用机制之一，尤其是生肌、修复方面。然而，朱槿花苞具体作用机制仍需进一步深入研究。

实验结果显示，提取物HrBN在实验d 3可见超过半数的小鼠造模处结痂，于d 5，可见约3／4小鼠造模处组织生长良好，部分小鼠可见愈合瘢痕。而模型组则在d 5和d 8才分别达到上述康复程度。综上所述，朱槿花苞提取物促进皮肤疖痈溃疡修复的作用不仅补充了朱槿花系列研究，同时对于后期研发和成为功能型产品奠定了一定的基础。

（致谢：鸣谢中国中医科学院中药所林娜教授在实验过程中的支持与帮助。）

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Research in skin healing and repair function and mechanism of Hibiscus rosa-sinensis Linn bud extract

JIANG Ji-yang，XU Han，BAI Xue-ting，CHENG He，LING Yan-ling，LING Zhen，CHEN Yi-cun，SHI Gang-gang
（Pharmacology Division of Shantou University，Shantou Guangdong 515041，China）

Abstract：Aim To test the skin healing and repairing efficacy and the mechanism of Hibiscus rosa-sinensis L bud extract by using the animal models．Methods KM mice were randomly divided into three groups：the model group，the positive control group，and the n-bu-tyl alcohol extract（HrBN）group．Using the boils and carbuncles model，the healing condition of all the animals were observed．KM mice were kept in thebook=1091,ebook=60SPF condition room and divided into five groups：the model group，the positive control group，and the low，middle，high dose groups．Using the full-thickness loss model，the repairing results of all the mice were ob-served．Through the antimicrobial test，the results of MIC and inhibition zone were obtained．The carbon clearance test was used to collect the blood at the time 5min and 15min，and get the liver and spleen，and the results of K and α were obtained．Results In vivo ex-periments showed there was significant difference be-tween groups；the HrBN extract had the outstanding ef-ficacy in healing and repairing skin boils and full-thickness loss models．It had higher recovery rate than other ethanol extract，such as ethyl acetate extract and chloroform extract．In vitro experiments showed that the HrBN extract，ethyl acetate extract（HrBE），AB-8 macroporous resin 30%alcohol part and 60%alcohol part had obvious antimicrobial efficacy．The carbon clearance test showed HrBN had a good effect in im-proving immune function，and it can increase the K and α．Conclusion HrBN in animal models exerts good skin healing and repairing efficacy，which might be related to its antibacterial activity and immunologic enhancement function．

Key words：Hibiscus rosa-sinensis Linn bud；n-butyl alcohol extract；boils and carbuncles model；full-thick-ness loss model；antimicrobial；carbon clearance test

作者简介：姜霁洋（1990－），女，硕士，研究方向：中药药理学，E-mail：tianhexingji＠126．com；石刚刚（1957－），男，博士，教授，博士生导师，研究方向：中药药理学，通讯作者，E-mail：ggshi＠stu．edu．cn

基金项目：广东省自然科学基金－团队项目（No 9351503102000001）；中央财政支持地方高校发展专项资金

收稿日期：2015－05－18，修回日期：2015－06－14

文献标志码：A

文章编号：1001－1978（2015）08－1085－07

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．08．012