CP节律性化疗对人脐静脉内皮细胞及其中自噬相关蛋白Beclin1、LC3的影响

郭列平，周　帆，石昊天，陈海敏，凌晨晖，陈小玲，侯　健,2

1.200070，上海市闸北区中心医院血液肿瘤科；2.200003上海，第二军医大学长征医院血液科

CP节律性化疗对人脐静脉内皮细胞及其中自噬相关蛋白Beclin1、LC3的影响

郭列平1，周帆1，石昊天1，陈海敏1，凌晨晖1，陈小玲1，侯健1,2

1.200070，上海市闸北区中心医院血液肿瘤科；2.200003上海，第二军医大学长征医院血液科

2003年起，本课题组应用持续低剂量环磷酰胺(CTX, 50 mg/d) 联合泼尼松(Pred, 15 mg/d) 持续口服的方案(即CP节律性化疗)治疗伴有严重并发症的多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)患者[1-3]和复发/难治性MM患者[4]，均取得了明显疗效。本课题组进一步在CP方案治疗前和治疗后第2、4、6个月取患者骨髓组织及外周血，应用免疫组织化学法分析骨髓组织微血管密度(microvessel density, MVD)，ELISA法检测外周血中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和血小板衍生生长因子BB(platelet derived growth factor BB, PDGF-BB)表达水平[5]。结果发现，CP方案可明显降低MM患者骨髓局部的微血管密度、血清VEGF及PDGF-BB水平，提示其对MM的治疗作用可能与抑制新生血管的生成有关。

为进一步探讨CP节律性化疗的抗血管新生机制，笔者设计了体外试验。由于环磷酰胺在体外无活性，需经肝脏代谢为磷酰胺氮芥(phosphoamide, PM)发挥抗肿瘤作用。故在本研究中，笔者通过建立低剂量磷酰胺氮芥联合泼尼松龙(可等同于CP节律性化疗)处理的HUVEC模型，通过CCK8法及流式细胞术检测CP节律性化疗对HUVEC增殖及凋亡的影响，之后应用Western Blot及RT-PCR等方法检测该处理对自噬相关蛋白Beclin1及LC3等表达的调控，进而探讨CP节律性化疗方案抑制HUVEC生长的可能机制。

1材料与方法

1.1细胞及分组HUVEC购自中国科学院细胞库，于37 ℃、5%CO2环境培养。HUVEC在实验前2 d进行消化收集，以相同的细胞量接种至各个培养皿中并分别进行加药处理，实验分组如下：二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)对照组，磷酰胺氮芥组，泼尼松龙组，磷酰胺氮芥+泼尼松龙组(CP组)，每组重复3次。处理48 h后，收集细胞用于后续流式细胞术或是分子水平检测。依据文献[6，7]及结合笔者的预实验，CP节律性化疗方案中磷酰胺氮芥浓度定为5 μg/ml，泼尼松龙浓度定为50 μmol/L。

1.2HUVEC 增殖凋亡的检测

1.2.1CCK8法检测细胞增殖将处于对数生长期的各组的细胞株，用胰蛋白酶消化，稀释细胞使其浓度为5×104/ml培养液，分别取100 μl至96孔培养板，每种细胞每块板接种3个同样的孔作为复孔，(1～5)×103/孔，以100 μl培养液作为空白对照，37 ℃培养过夜；按1∶10体积比混合Cell Counting Kit -8(CCK-8)和无血清必需基本培养液DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle Medium，Dulbecco 改良的Eagle培养液)，每孔100 μl加入待测孔中，37 ℃，5% CO2孵育1 h；用微板分光光度计测定450 nm波长光密度(optical density，OD值)。记录每块板的数值，再计算不同时间不同组药物对HUVEC的增殖抑制率。实验重复3次，取均值计算细胞的增殖抑制率。增殖抑制率=[(DMSO对照组OD值-实验组OD值)/DMSO对照组OD值]×100%。

1.2.2流式细胞术检测细胞凋亡分别取各组培养的HUVEC，经0.25%胰蛋白酶消化后，用PBS洗涤2次，调整细胞密度为1×106/L，制成单细胞悬液，加入100 μl Binding Buffer 和FITC标记的Annexin-V(20 μg/ml)10 μl，室温避光30 min，再加入PI (50 μg/ml) 5 μl，避光反应5 min后，加入400 μl Binding Buffer，立即用FAC Scan进行流式细胞仪定量检测其凋亡水平。

1.3Western Blot检测细胞置于冰上，用PBS洗3次，加入蛋白裂解液及苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)，冰上放置40 min，4 ℃，12 000 r/min离心40 min，取上清。以BSA为标准，用Bradford法对上清进行蛋白定量。取20 μg蛋白样品，10% SDS-PAGE电泳，100 V转移1 h至硝酸纤维素薄膜，放入封闭液中37 ℃封闭1 h，一抗4 ℃过夜。同时，另1张用不含抗体三羟甲基氨基甲烷-吐温缓冲液(tris buffered saline and tween，TBST)孵育，作为阴性对照。反复洗膜后，将膜与碱性磷酸酶(AP)标记的抗IgG抗体孵育，室温轻摇1 h，洗膜后，用Western blotting印迹观察，用图像分析测定各带吸光度(A)值作定量分析。

1.4RNA抽提收集10 cm培养皿细胞，放到1.5 ml EP管中，加入1 ml Trizol。震荡30 s。加0.2 ml氯仿，剧烈摇动30 s，室温3 min。12 000×g，4 ℃离心，15 min。吸上层无色水相，移入另一EP管中(约0.5 ml)。加等体积异丙醇，-20 ℃，30 min。12 000×g，4 ℃离心，10 min。在管底部可见微量RNA沉淀。弃上清，加75%乙醇1 ml，振荡。7500×g，4 ℃离心，10 min。弃上清，用滤纸小心吸取残留液体，室温干燥5～10 min。沉淀溶于20 μl焦碳酸二乙酯(Diethy pyrocarbonate, DEPC)水，取1 μl加入79 μl DEPC水测OD260/OD280。计算浓度与纯度，-70 ℃保存。

1.5反转录合成cDNA及荧光定量PCR检测自噬相关蛋白Beclin1和LC3反应体系如下：RNA 5 μl，Radome引物2 μl，RNA sin 0.5 μl，65 ℃，15 min，立即放入冰浴。RT反应体系：约2 h RNA sin 0.5 μl，10 mM dNTP 1 μl，5×RT缓冲液4 μl，25 mM MgCl24 μl，AMV反转录酶3 μl，混匀快速离心一次，-20 ℃冰箱冻存。按如下配方配制q-PCR反应体系：(Beclin1，LC3)上下游引物10 pmol/μl，cDNA模板2.0 μl，ddH2O 7 μl，SYBRGREEN kit，10 μl，上述反应体系置于ABI 7500荧光定量PCR仪中，采用标准反应步骤进行反应。

1.6统计学处理采用SPSS 11.5统计软件，多组均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1CP节律性化疗对HUVEC增殖的影响随着时间的延长，PM、泼尼松龙及CP组均使HUVEC的增殖抑制率明显提高，差异均具有统计学意义(P均<0.001)。在作用HUVEC细胞24 h时，不同组的药物对细胞的增殖抑制率也明显不同，泼尼松龙组对细胞的抑制率最弱，而CP组对细胞的增殖抑制率最强，PM组次之，差异均具有统计学意义(P均<0.01)，而作用48 h和72 h时，不同组药物对HUVEC的增殖抑制率差异更大，差异均具有统计学意义(P均<0.01，表1)。

表1　CP节律性化疗对HUVEC细胞的增殖抑制率　(n=3；

注：与泼尼松龙组比较，①P<0.01；与PM组比较，②P<0.01；PM为磷酰胺氮芥，CP为磷酰胺氮芥+泼尼松龙

2.2CP节律性化疗对HUVEC凋亡的影响用药处理48 h后，DMSO对照组使HUVEC凋亡率达到4.67%±0.21%，而泼尼松龙组、PM组、CP组HUVEC凋亡率依次更高，泼尼松龙使HUVEC细胞的凋亡率达到10.43%±0.50%，PM使HUVEC细胞的凋亡率达到15.60%±0.72%，二者联用后，即CP组能使HUVEC细胞的凋亡率达到23.83%±0.80%，差异有统计学意义(P均<0.001，图1)。

图1　CP节律性化疗对HUVEC凋亡的影响

2.3自噬相关蛋白Beclin1和LC3的表达Western Blot和RT-PCR检测结果均显示，用药处理48 h后，与DMSO对照组相比，泼尼松龙组、PM组、CP组对HUVEC细胞的Beclin1、LC3蛋白表达和mRNA表达均依次下降，提示CP组能使HUVEC自噬相关蛋白Beclin1和LC3的表达明显下调，差异均具统计学意义(P均<0.01, 表2)。

表2　不同组药物处理HUVEC后自噬相关蛋白Beclin1和LC3蛋白及mRNA表达情况　(n=3；

注：与DMSO对照组比较，①P<0.01；与泼尼松龙组比较，②P<0.01；与PM组比较，③P<0.01；PM为磷酰胺氮芥，CP为磷酰胺氮芥+泼尼松龙

3讨论

MM是一种起源于浆细胞的恶性克隆性疾病，常合并有骨质破坏、肾功能不全、高钙血症、感染、造血功能损害、高黏滞综合征、淀粉样变，以及神经系统损害等。由于这些并发症的存在，患者一般状况较差，加之患者多为老年人，常合并其他疾病，这些因素都限制了细胞毒化疗药物在MM治疗上的应用。

目前，节律性化疗在实体肿瘤方面已经取得了显著的疗效[8-14]。环磷酰胺联合泼尼松节律性化疗对淋巴瘤的生长有较强的抑制作用[15]，对MM也有很好的治疗作用[16-18]，但是其分子机制仍然不明。本研究结果表明，CP节律性化疗能使HUVEC增殖大幅度降低，加速了HUVEC的凋亡，支持了笔者前期研究结果CP节律性化疗可以抑制血管内皮细胞的增殖，对MM的治疗具有重要意义。

自体吞噬(简称自噬)是细胞自身降解陈旧蛋白、细胞器，回收利用氨基酸、核酸等小分子以实现自身代谢需要和某些细胞器更新的过程。在营养缺乏等特殊环境下，自噬可以通过与凋亡不同的降解机制(膜包被降解)和分子机制(特定基因的激活)，使细胞程序性死亡。在肿瘤发展的早期，自噬现象能够抑制肿瘤的形成，如果此时阻碍自噬，将会促使癌前病变的发生[19]。自噬通过调节细胞内过氧化物浓度，改变体内蛋白代谢紊乱状态，保持细胞内环境稳定，抑制肿瘤的形成[20]。而Beclin1是调控自噬的重要基因。自噬基因Beclin1是酵母ATG6的同系物，也是哺乳动物参与自噬的特异性基因。人类Beclin1基因位于染色体17q21上，是一个双等位肿瘤抑制基因。Beclin1缺陷明显增加肝癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌的发生率[21]。LC3是酵母ATG8基因在哺乳动物中的同源物，定位在自噬体膜上，参与自噬体的形成，特异地反应细胞内自噬体的数量，现已作为自噬体的特异性标记蛋白[22]。通过本研究，我们发现CP节律性化疗能显著降低HUVEC细胞自噬相关蛋白Beclin1和LC3蛋白和mRNA的表达水平，提示其对血管内皮的抑制作用中有自噬相关蛋白的参与。

VEGF在骨髓瘤细胞表达显著升高，当其被干扰后，骨髓瘤细胞U266的增殖能力、迁移能力受到显著的抑制[23]。本课题组前期研究也发现，CP节律性化疗可明显降低MM患者骨髓局部的微血管密度，血清VEGF及PDGF-BB水平[5]。但Beclin1与VEGF的作用关系目前研究较少。文献[24]报道，在宫颈癌细胞系CaSki cells中pcDNA3.1-Beclin1过表达，而VEGF的蛋白水平显著降低，并且导致肿瘤细胞的迁移水平升高。另有文献[25]报道，贝伐单抗治疗也上调自噬相关基因Beclin1和LC3的表达，并增加自噬体的形成。但抑制自噬能增加活性氧(ROS)的生成，并明显增加肝癌细胞系HCC细胞在低营养和低氧环境下的凋亡水平。而联合自噬抑制剂和贝伐单抗较单用更能抑制HCC异种移植物的肿瘤生长，提示自噬抑制药可能是增加抗血管新生制剂有效性的一种新的方法。本研究发现，CP节律性化疗能使HUVEC细胞Beclin1和LC3的表达水平显著降低，但HUVEC凋亡明显增高，提示CP节律性化疗不仅抑制血管新生，还可抑制自噬。笔者推测，CP节律性化疗在调控Beclin-1和VEGF的同时，还可能影响ROS的生成，从而影响血管新生(有待于实验进一步证实)。因此，自噬的下调可以提高HUVEC对CP节律性化疗的敏感性。

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(2014-11-25收稿2014-12-29修回)

(责任编辑武建虎)

【摘要】目的研究持续低剂量磷酰胺氮芥(phosphoamide, PM)联合泼尼松龙(CP节律性化疗方案)对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)自噬相关蛋白Beclin1和LC3表达水平的影响，探讨节律性化疗增加HUVEC对化疗药物敏感性的机制。方法实验分DMSO对照组、磷酰胺氮芥(PM)组、泼尼松龙组、磷酰胺氮芥+泼尼松龙组(CP组)，每组重复3次。采用不同的药物处理HUVEC，用CCK8法检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞凋亡，免疫印迹法和反转录PCR检测自噬相关蛋白的表达水平。结果(1)与DMSO对照组相比，随着时间的延长，PM、泼尼松龙及CP组均使HUVEC的增殖抑制率明显升高(P均<0.001)，并且在相同作用时间，不同组的药物对细胞的增殖抑制率也明显不同，泼尼松龙组对细胞的抑制率最低，而CP组对细胞的增殖抑制率(72 h，25.1%±0. 7%)最高，PM组(72 h，20.4%±0.7%)次之(P均<0.01)；(2)用药处理48 h后，与DMSO对照组相比，泼尼松龙组、PM组、CP组使HUVEC细胞的凋亡率依次增高(P均<0.001)；(3)用药处理48 h后，与DMSO对照组相比，泼尼松龙组、PM组、CP组的Beclin1、LC3的蛋白表达和mRNA表达水平均依次下降(P均<0.001)。结论人脐静脉内皮细胞HUVEC经CP节律性化疗方案处理后，可以显著降低HUVEC细胞的增殖水平，促进HUVEC细胞的凋亡，并显著降低自噬相关蛋白Beclin1和LC3的表达水平。

【关键词】节律性化疗；自噬相关蛋白；Beclin 1；LC3

【中国图书分类号】R733

Effect of CP metronomic chemotherapy on HUVEC cells and autophagy-related protein Beclin1 and LC3

GUO Lieping1, ZHOU Fan1, SHI Haotian1, CHEN Haimin1, LIN Chenhui1, CHEN Xiaoling1, and HOU Jian1, 2.1. Department of Hematology and Oncology, Shanghai Zhabei District Central Hospital, Shanghai200070, China; 2. Department of Hematology, Changzheng Hospital, the Second Military Medical University, Shanghai 200003, China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of CP metronomic chemotherapy on HUVEC cells and autophagy-related protein, Beclin1 and LC3, expression levels, and to explore the mechanism of CP program increasing sensitivity of HUVEC cells to chemotherapeutic drug. MethodsSubjects were divided into the DMSO control group, and the phosphoramide mustard (PM) group, the prednisolone group, the phosphoramide mustard and prednisolone group (the CP group). HUVEC cells were treated with different drugs. CCK8 method was used to detect cell proliferation, flow cytometry to detect the cell apoptosis, Western blot and RT-PCR to detect autophagy-related protein levels. ResultsCCK8 method showed that compared with DMSO control group, in the PM, the prednisolone and the CP groups, HUVEC cell proliferation inhibition rates increased significantly with the extension of time (P<0.001). And at the same time, the different drug groups were significantly different in cell proliferation inhibition rate, the prednisone group was the weakest, the CP group(72 h，25.1%±0. 7%)was the strongest, and the PM group (72 h，20.4%±0.7%) was intermediate(P<0.01). Flow cytometry showed that after 48 hours, compared with the DMSO control group, the prednisolone, the PM and the CP groups made HUVEC cell apoptosis rate increased in turn (P<0.001). Western blot and reverse transcription PCR showed that after 48 hours, compared with the DMSO control group, Beclin1 and LC3 protein and mRNA expression decreased in turn in the prednisolone group, the PM group and the CP group(P<0.001). ConclusionsHUVEC cells treated with CP metronomic chemotherapy can significantly reduce the level of HUVEC cell proliferation, promote HUVEC cell apoptosis, and significantly reduce autophagy-related protein expression levels of Beclin1 and LC3.

【Key words】metronomic chemotherapy；autophagy-related protein；Beclin 1; LC3

通讯作者：侯健，E-mail：houjian167@sohu.com

作者简介：郭列平，硕士，副主任医师，E-mail：glplaying2000@163.com